南开大学基因操作原理 复习要点
南开大学 基因操作原理 第三章
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Useful Enzyme as tool in Gene manipulation
Chapter 3
Cutting and joining DNA molecular
1
? 1st ? 2nd
? 3rd
in vitro in vivo
2
PCR RT-PCR
End modification
3
1. Overview of Useful Enzymes for Molecular Cloning
1) Host-controlled restriction and modification 2) Restriction enzyme and modification enzyme 3) Types of restriction enzymes 4) Nomenclature of restriction enzymes 5) Target site of restriction enzymes 6) Isoschizomer 7) Isocaudamer
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1) Host-controlled Restriction and Modification
Phage infects bacteria
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Restriction-Modefication (R-M) system
Two enzyme activity in host: (1) Restriction endonuclease enzyme (2) Modification methyltransferase
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
南开大学基因操作原理 大题回忆版
简答题:1.puc19蓝白筛的原理2.简述pcr的原理和标准热循环3.给定真核质粒(1)确定是真核表达载体还是原核表达载体(2)是否需要对准读码框(3)载体上的f1 ori，pUC ori，Sv40 ori 的作用分别是什么实验设计题A蛋白在正常293T细胞中不表达，但在干扰素的作用下能让293T细胞大量表达A蛋白。
A 蛋白基因序列已知，但不能直接合成。
构建原核表达载体（带有His tag和T7promotor）使A蛋白在大肠杆菌中进行表达，同时获得A蛋白。
现代生物技术发展对微生物发酵工程的影响答:1、阐述一下现代生物技术都有哪些？现代生物技术有基因工程，细胞工程，合成生物学，生物信息学，基因组学、蛋白质组学、蛋白质工程等。
2、突出重点强调：其中基因工程和细胞工程是生物技术的主导领域和热点领域，常常是发酵工程和酶工程的基础。
3、重点强调的优点：传统的发酵工程利用天然微生物进行发酵生产初级代谢产物和次级代谢产物，由于生物技术的出现和日益革新，发酵工程所涉及的范围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。
基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发不少产品投入市场，如胰岛素、干扰素等。
在氨基酸工程菌组建上也获得成功。
酶工程的固定化细胞发酵的优点在于简化生产工序、降低成本、节约原材料和能源、提高产量和收率以及改善环境污染的能力，在各领域中得到广泛应用。
4、其他新兴学科在这些技术中的辅助和应用：合成生物学的开创和发展，为微生物发酵工程中菌种的选育、构建提供了基础。
这一新兴学科主要建立在将有功能活性的生物功能性小部件拼凑在一起发挥功能利益最大化。
这在微生物发酵过程中的菌种培育和筛选阶段起到了极其巨大的作用。
虽然现在这一技术还未被广泛应用到实际工业生产中，但其潜在的商业价值可见一斑。
生物信息学是21世纪的新兴学科。
它是研究神武信息的采集、处理、存储、传播和分析等各方面学科。
随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，两者的结合将揭示大量而复杂的生物数据所赋予的生物学奥秘。
基因操作原重难点总结
基因操作原理重难点总结1. 基因克隆的宏观策略：答：⑴已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因)：根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因；⑵定位在质粒上的基因克隆：利用识别六碱基的限制性内切酶酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异探针进行杂交，确定基因片段进行克隆；⑶定位在染色体组上的基因克隆：①杂交方法：ⅰ.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。
再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。
ⅱ.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，再进行克隆筛选。
②免疫抗体法：利用鸟枪法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。
③利用简并引物的PCR方法：对目标基因的蛋白质进行N-端氨基酸残基分析。
根据氨基酸序列反推目标基因设计简并引物，以基因组DNA 为模板进行PCR扩增，获得目标基因。
④转座子插入失活克隆法：用转座子对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用转座子序列信息设计特异探针，进行TAIL-PCR双向扩增，从而获得完整基因。
⑤质粒拯救法：利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序。
⑥功能克隆法(基因表达产物应有明显的表型效应)：利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。
⑦通过双杂交系统克隆新基因：通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。
⑧通过蛋白质组学技术克隆基因：通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因。
2. 设计从某一生物中克隆某一基因的技术路线：答：原核生物：从样品中抽提总DNA，部分酶切，构建合适载体——将目标DNA片段与载体连接——转入宿主细胞培养——可以根据该目标基因所表现出的特定表型筛选，或是利用核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法筛选。
基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结
基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结一、基因工程技术的原理基因工程技术，简单来说，就是在分子水平上对基因进行操作的技术。
其核心原理包括以下几个关键步骤：1、目的基因的获取目的基因是我们想要研究或应用的特定基因片段。
获取目的基因的方法多种多样，常见的有从基因文库中筛选、通过 PCR 技术扩增以及人工化学合成等。
2、基因载体的选择基因载体就像是一辆“运输车”，负责将目的基因运送到受体细胞中。
常用的基因载体有质粒、噬菌体和病毒等。
它们具有能够在宿主细胞中自主复制、稳定存在等特点。
3、基因重组将获取的目的基因与选择好的基因载体进行连接，形成重组 DNA分子。
这个过程需要用到特定的限制性内切酶和 DNA 连接酶，以确保目的基因能够准确无误地插入到载体中。
4、重组 DNA 导入受体细胞将构建好的重组 DNA 分子导入到受体细胞中，使其能够在受体细胞内稳定遗传和表达。
导入的方法包括转化、转导、显微注射等。
5、目的基因的检测与鉴定导入受体细胞后，需要对目的基因是否成功导入、是否表达以及表达水平等进行检测和鉴定。
常用的方法有核酸分子杂交、PCR 检测、蛋白质检测等。
二、基因工程技术的应用例题1、胰岛素的生产糖尿病患者需要定期注射胰岛素来控制血糖。
传统的胰岛素提取方法产量低、成本高。
通过基因工程技术，科学家将人的胰岛素基因导入到大肠杆菌中，让大肠杆菌能够大量合成胰岛素，大大提高了胰岛素的产量，降低了成本，为糖尿病患者带来了福音。
2、转基因抗虫棉棉花在生长过程中常常受到棉铃虫等害虫的侵害。
利用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌中的 Bt 毒蛋白基因导入到棉花细胞中，使棉花能够自身合成毒蛋白，从而具有抗虫的特性，减少了农药的使用，保护环境的同时提高了棉花的产量。
3、基因治疗对于一些由于基因突变导致的遗传性疾病，如血友病、囊性纤维化等，基因治疗为患者带来了新的希望。
通过将正常的基因导入患者的细胞中，以替代或修复突变的基因，从而达到治疗疾病的目的。
基因操作原理知识点总结
基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。
通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。
在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。
基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。
这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。
利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。
基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。
基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。
基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。
其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。
基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结
基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结一、基因工程技术的原理基因工程，也称为重组 DNA 技术，是一种在分子水平上对基因进行操作和改造的技术。
其基本原理是在体外将不同来源的 DNA 分子进行剪切、拼接和重组，然后将重组的 DNA 分子导入到受体细胞中，使其在受体细胞中表达和遗传。
基因工程的操作主要包括以下几个步骤：1、目的基因的获取从生物体的基因组中直接分离：对于一些结构和功能比较清楚的基因，可以通过限制性内切酶将其从基因组 DNA 中切割下来。
人工合成：如果已知基因的核苷酸序列，可以通过化学方法人工合成目的基因。
PCR 扩增：利用聚合酶链式反应（PCR）技术，以少量的 DNA 为模板，快速扩增出大量的目的基因。
2、基因载体的选择和构建基因载体是能够携带目的基因进入受体细胞的工具。
常用的基因载体有质粒、噬菌体和病毒等。
载体需要具备自我复制能力、多个限制性内切酶切点、标记基因等特点。
3、目的基因与载体的连接通过限制性内切酶切割目的基因和载体，产生相同的黏性末端或平末端。
然后利用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组 DNA 分子。
4、将重组 DNA 分子导入受体细胞常用的导入方法有转化（细菌）、转染（动物细胞）和农杆菌介导转化（植物细胞）等。
5、重组体的筛选和鉴定由于导入受体细胞的重组体中可能存在未成功重组的分子，因此需要进行筛选和鉴定。
常用的筛选方法有抗性筛选、标记基因筛选、核酸分子杂交筛选等。
二、基因工程技术的应用例题1、基因工程在农业领域的应用抗虫棉的培育：将苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因导入棉花细胞中，培育出具有抗虫特性的棉花品种。
举例：某地区常年遭受棉铃虫的侵害，导致棉花产量大幅下降。
科研人员通过基因工程技术，将一种能够编码产生杀虫蛋白的基因导入棉花植株中。
经过筛选和培育，获得了抗虫棉新品种。
在种植过程中，这种抗虫棉能够有效地抵御棉铃虫的危害，减少了农药的使用量，提高了棉花的产量和质量。
南开大学 基因操作原理_第十二章
8 L.) Avilés, F., et al., (2009) Effect of Culture Medium in Callogenesis from Adult Walnut Leaves (Juglans regia Chilean Journal of Agricultural Research, 69(3):460-467.
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PLANT MATERIAL
Callus: Suspension culture cell: Protoplast: Explant or planta:
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CALLUS
Equimolar amounts of auxin and cytokinin stimulate cell division. Leads to a proliferation of an undifferentiated mass of cells called a callus.
Gram negative bacteria
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2. Signal molecules produced by wounded plants:
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3. True oncogene transformation:
Wound infected with A. tumefaciens Crown gall
Involved in wound responses Ethylene Absolutely essential Induce shoots formation Zeatin [a cytokinin] Promotes leaf abscission 11 and seed dormancy Abascisic acid (ABA)
Tissue grows as callus in the absence of phytohormone
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大肠杆菌受体优点：1、易转化；2、可使用多种易操作的载体，宿主范围较大
缺点：1、缺少辅助功能的生化途径，这些有利于表型功能的研究，如芳香族的降解、抗生素的合成、致病性、孢子形成等
在新宿主中克隆有3个先决条件：
1、具有将目的基因导入受体的方法：转化、接合、电穿
孔；
2、目的基因在受体菌中能稳定存在：以复制子的形式或
整合到基因组中、前质粒中；
3、目的基因在表达时能被检测到
目的基因的导入
其他菌的转化特点：1、自然发生，转化能力是一个短暂现象
2、在一些菌中，转化是独立序列进行的
3、自然转化机制涉及到DNA双螺旋的断裂，并降解其中一条单链，使得另外一条能够进入宿主
方法：感受态细胞的转化、原生质体的转化、电穿孔、质粒援救转化
目的基因的稳定
重组DNA分子通常以CCC的形式存在于质粒中，而后者主要取决于质粒的宿主范围（编码复制过程的蛋白质的数量），如S.aureus 的
质粒和RSF1010均可在G+或G-中复制
为了扩大宿主范围，通用方法为形成杂交质粒。
如大肠的pBR322和S.aureus或B.subtilis 的pC194、pUB110的混合穿梭质粒。
它的特点，人工构建、两种不同复制起点和选择标记，能在两种类群宿主中存在并复制。
它的优点是大肠能够成为克隆的中间宿主
重组DNA的综合
重组质粒进入宿主细胞后，通常会有以下结果：
1）以稳定的质粒形式存在
2）丢失
3）通常整合到基因组中
4）同源重组：代替经常是双链交换
例子：构建了一个集合质粒：neomycin抗性基因和B.subtilis
的amyE基因插入到pBR322中，将这个质粒转入B.subtilis，
该质粒不能复制，但如果筛选为抗性而做，那么质粒的集合
就在amyE处进行。
这一方法可用于构建单拷贝的外源基因
的重组子。
G-中的clone经常以大肠作为中间体，因此所需质粒必须能。