基因克隆原理及实验介绍
基因克隆的原理
基因克隆的原理基因克隆是一种重要的生物技术手段，可以通过复制和传递DNA 分子，实现对特定基因的扩增和增殖。
基因克隆的原理是利用DNA 重组技术，将所需基因的DNA片段插入到载体DNA上，然后将重组的DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆的过程可以分为DNA分离、DNA切割、DNA连接和DNA转化等几个步骤。
需要从源生物体中提取目标基因所在的DNA。
DNA分离是基因克隆的第一步，通常使用细菌或真菌等生物作为DNA的来源。
提取DNA的方法有很多种，常见的有碱裂解法和酚氯仿法等。
这些方法能够将DNA从细胞中释放出来，获得纯净的DNA溶液。
接下来，通过DNA酶切割技术将目标基因从DNA中剪切出来。
DNA酶切割是基因克隆的关键步骤，通过使用特定的限制性内切酶，可以将DNA分子切割成特定的碎片。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在特定的酶切位点上切割DNA，产生具有粘性末端的DNA片段。
然后，将目标基因与载体DNA进行连接。
载体是一种能够自我复制的DNA分子，可以将目标基因插入到载体中进行复制和表达。
常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
连接的方法有多种，常见的是使用DNA连接酶将目标基因与载体DNA连接起来。
连接后的DNA分子称为重组DNA。
将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是指将重组DNA导入到宿主细胞中，使其能够进行复制和表达。
常用的转化方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
转化后，宿主细胞将能够复制和表达重组DNA 中的目标基因。
基因克隆技术的应用非常广泛。
通过基因克隆，可以获得大量目标基因的DNA，用于研究基因的结构和功能，以及开发新的药物和治疗方法。
此外，基因克隆还可以用于制备重组蛋白、产生转基因生物和进行基因治疗等领域。
总结起来，基因克隆的原理是利用DNA重组技术将目标基因插入到载体DNA中，然后将重组DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆技术的应用非常广泛，对于研究基因和开发生物技术具有重要意义。
基因克隆技术的原理与方法
基因克隆技术的原理与方法在人类历史上，基因一直是科学家们探究的热点之一。
随着科技的不断发展，基因克隆技术逐渐被应用于生物医学和生命科学领域，成为这个领域的重要组成部分。
那么，基因克隆技术的原理和具体方法是什么呢？基因克隆技术的原理基因克隆技术是指通过分子生物学技术，将特定的DNA序列复制并扩增，最终得到大量相同的DNA片段的过程。
在这个过程中，使用的主要技术是PCR和DNA重组技术。
PCR（聚合酶链式反应）是一种将小段DNA片段扩增为大量DNA的技术。
它是一种非常高效的DNA复制方法，经过多次扩增可以得到数百万、数千万甚至数十亿倍的DNA。
DNA重组技术是一种将两个不同种类DNA片段组合成一个新的DNA分子的方法。
这个过程通常包括三个步骤：1）通过限制性内切酶切割DNA，得到特定的DNA片段；2）将这些DNA片段与载体DNA序列进行融合；3）通过转化或转染等方法将重组后的DNA引入宿主细胞中，让它开始复制。
利用PCR和DNA重组技术，科学家们可以快速扩增任何一种特定的DNA序列，或者将不同DNA序列进行组合重组，从而高效地制造出人工合成的DNA序列。
同时，这些技术还可实现基因靶向分析、疾病诊断、基因治疗等多种应用。
基因克隆技术的方法通过PCR和DNA重组技术，科学家们可以使用多种不同的方法实现基因克隆。
下面我们就来介绍一些常用的基因克隆方法。
1. 基本的基因克隆方法这种克隆方法包括PCR扩增和限制性内切酶切割，并且可以使用装载体如质粒或病毒来转化宿主细胞。
这种克隆方法常用于基因分析、疾病诊断中。
2. 聚合酶链式反应（PCR）法PCR法是一种基于DNA聚合酶在适当条件下的多次循环扩增DNA片段的技术。
具体步骤如下：将DNA分子用特定的引物扩增引导器识别特定的DNA，然后将扩增反应放到恒温器中进行放大，每循环一次会将扩增的DNA片段分裂成两条链，出现两个新的单链DNA前体，从而实现了DNA聚合。
3. 环状扩增法环状扩增法适用于小片段DNA的克隆，其具体步骤是：用引物识别特定的DNA，然后使用聚合酶以及低成本的环形引物扩增DNA片段。
实验室克隆技术解析
实验室克隆技术解析实验室克隆技术是一种重要的生物技术手段，它可以通过复制和重组DNA分子，实现对生物体的复制和改造。
本文将对实验室克隆技术进行详细解析，包括克隆的原理、方法和应用。
一、克隆的原理实验室克隆技术的原理是基于DNA的复制和重组。
DNA是生物体遗传信息的载体，通过复制和重组DNA分子，可以实现对生物体的复制和改造。
克隆的原理主要包括以下几个步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA分子，通常使用化学方法或者机械方法进行提取。
2. DNA复制：将提取到的DNA分子进行复制，通常使用聚合酶链式反应（PCR）或者细菌的DNA复制机制进行复制。
3. DNA重组：将复制得到的DNA分子与载体DNA进行重组，通常使用质粒或者病毒作为载体。
4. 转化：将重组后的DNA分子导入到宿主细胞中，使其表达目标基因。
二、克隆的方法实验室克隆技术有多种方法，常用的方法包括限制性内切酶切割、DNA 连接、转化和筛选等。
1. 限制性内切酶切割：限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并切割DNA分子的酶，通过限制性内切酶的作用，可以将DNA分子切割成特定的片段。
2. DNA连接：将切割得到的DNA片段与载体DNA进行连接，通常使用DNA连接酶进行连接。
3. 转化：将连接后的DNA分子导入到宿主细胞中，使其表达目标基因。
转化的方法有多种，包括化学法、电穿孔法和冷冻法等。
4. 筛选：通过筛选方法，筛选出含有目标基因的克隆体。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选和PCR筛选等。
三、克隆的应用实验室克隆技术在生物学研究和生物工程领域有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 基因功能研究：通过克隆技术，可以将目标基因导入到宿主细胞中，研究其在生物体中的功能和作用机制。
2. 基因工程：通过克隆技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，使其表达目标蛋白质，用于生物制药和农业改良等领域。
3. 基因治疗：通过克隆技术，可以将正常基因导入到患者的细胞中，修复或替代异常基因，用于治疗遗传性疾病。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆是一种技术，它使用质粒或DNA片段来复制一个特定的基因序列。
这种技术可以被用来产生大量相同的基因，以改变物种的表型特征，也可以用来研究有关基因的功能、结构和表达的有关信息。
基因克隆的基本原理是使用一种叫做酶切的酶，通过限制性内切酶将DNA片段分割成较小的片段，然后使用DNA 聚合酶将它们连接在一起。
这样，就可以生成几乎完全相同的DNA序列。
基因克隆的流程可以分为三个主要步骤：
1. 提取DNA：首先，由于想要克隆的基因位于一个细胞上，所以必须提取该细胞中的DNA。
常见的提取方法有水解法和溶剂提取法，其中水解法主要通过分解细胞壁和细胞质来提取DNA。
2. 克隆：其次，在提取出DNA后，使用限制性内切酶将DNA分割成较小的片段，然后使用DNA聚合酶将它们连接在一起。
3. 将克隆的DNA植入宿主：最后，将克隆的DNA植入一个宿主细胞，使其可以在宿主体内进行表达。
这里，一般会使用一种叫做质粒的DNA载体，它可以将克隆的基因植入宿主细胞中，从而使细胞获得克隆的基因。
基因克隆是一个复杂的流程，其中包括对基因的提取、克隆和植入宿主体等步骤，而且要完成克隆，还需要使用一系列不同的技术和工具，如限制性内切酶、DNA聚合酶和质粒等。
基因克隆技术在生物学、医学和农业等领域都有着重要的应用，它们已经成为研究基因功能、结构和表达的重要工具。
基因克隆的原理和应用
基因克隆的原理和应用一、基因克隆的原理基因克隆是一种重要的分子生物学技术，它可以用来在体外制备大量的DNA 分子，并将其插入到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆的原理主要包括以下几个步骤：1.选择目标基因：首先确定需要克隆的目标基因，这可以通过对生物学研究的需要来确定。
2.DNA提取和剪切：从源生物体中提取DNA，并使用限制性内切酶对DNA进行剪切。
限制性内切酶是一种能够识别特定核酸序列并剪切DNA链的酶。
3.载体的选择和制备：选择合适的载体，常用的载体包括质粒和噬菌体。
将目标基因插入载体中，并通过连接酶将其与载体连接。
连接酶可以将剪切的DNA片段与载体的末端互补序列连接起来。
4.转化和筛选：将构建好的重组载体转化到宿主细胞中，宿主细胞可以是细菌、酵母等。
然后通过筛选方法选出带有目标基因的克隆。
5.扩增和纯化：将成功筛选出来的克隆进行扩增，并使用DNA纯化技术提取目标基因。
二、基因克隆的应用基因克隆技术在生物科学研究、医学和工业生产等方面有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用领域：1. 生物科学研究•基因功能研究：通过基因克隆技术，可以将目标基因插入到其他生物体中，通过观察转基因生物的表型变化来研究这些基因在生物体中的功能。
•蛋白质表达：将目标基因插入到表达载体中，并将载体转化到大肠杆菌等表达系统中，可以大量表达蛋白质，并进行纯化和研究。
•基因组测序：通过克隆方法提取、扩增和纯化DNA片段，可以用于基因组测序或特定基因的测序。
2. 医学应用•基因治疗：将合成的基因导入到目标细胞中，通过修复或替代异常基因，治疗一些遗传性疾病。
•疫苗开发：通过克隆技术，可以制备重组疫苗，如乙型肝炎疫苗、人类乳腺癌疫苗等。
•药物研发：将目标基因插入到表达载体中，用于大规模表达药物靶点蛋白，以便进行药物筛选和药效评价。
3. 工业应用•农业：利用基因克隆技术进行作物遗传改良，提高作物产量、耐逆性等。
•能源生产：通过基因克隆技术改良生物质利用菌，提高生物质能源的产量和效率。
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• 稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100μM）的10倍量稀释至使用浓度10μM • 保存，分装-20℃
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏 • μM 是浓度单位，如100μM=100μmol/L • 引物稀释量向上取5倍整数，如383μl稀释至385μl
T4 DNA Ligase Total
用量 13-15μl
2-4μl 2μl 1μl 20μl
• 混匀，4℃过夜或常温条件下反应4h
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Objective
• 将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠 杆菌中大量复制
LB培养基配制
2μl
enzyme 1
2μl
enzyme 2 dd H2O
2μl 补至50μl
enzyme 2 dd H2O
2μl 补至50μl
*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度为455ng/μl，4000bp，反应体积约为9μl）
• 混匀，37℃孵育4-6h（6h以上更佳）
引物设计
pCR
回收纯化
凝胶浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
目的基因片段(bp) 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔）， 或插入孔径不同的梳子
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Primer Premier 5
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物处理 Procedure
• 标记，Sense → F，Antise → R ，如“NS3 Sense BamH1”，记为“NS3-F-BamH1”
• 离心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
备注
有2个突变 有2个突变 有2个突变
没有突变 没有突变 没有突变
有2个突变 有3个突变 有2个突变
结果
成功 成功 成功
成功 成功 成功
失败 失败 失败
胰蛋白胨（Tryptone） 酵母提取物（Yeast extract）
备注 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变
中间有2个位点突变
不配对 双峰 中间有1个位点突变
测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通
需要重新设计引物，直接pcr 需要重新设计引物，直接pcr 需要重新设计引物，直接pcr
需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。
• 目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。 • 原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时
根据分子大小不同形成不同的条带 • 根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶
成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
目的基因 NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS4A+2K-1 NS4A+2K-2 NS4A+2K-3
NS5-3
E
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
*凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射
• 按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Objective
• 原理：限制性内切酶能特异地结合于一段特定的DNA序列的特异位点上,并切割双链 DNA
• EB具有强致癌性，应在污染区操作
• 为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往 左点（靠近自己一段开始）
• Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同 条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA 样品的大小。
• 红色为正极，黑色为负极，DNA 样品由负极往正极泳 动（靠近加样孔的一端为负)。
390bp 390bp 390bp
1854bp 1854bp 1854bp
859bp 859bp 859bp
336bp 336bp 336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
，向上取整数（多预留延伸时间）
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置 • PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记 • 模板(Template)可根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。 • 注意不同引物对应不同PCR管 • PCR 结果优化略，详见《pCR常见问题解决方法》
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1
2000bp
1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
Байду номын сангаас物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Procedure
• 打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶 转移至1.5ml Ep 管里，称量凝胶重量
长度 1854bp 1854bp 1854bp
381bp 381bp 381bp
744bp 744bp 744bp
450bp 450bp 450bp
2700bp
1485bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
载体 目的片段
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增产物 纯化
与克隆载体 连接
感受态 E.coli制备
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
基因克隆
• 基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应 用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重 新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量 的子代DNA分子的过程。
• 目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag