基因治疗的原理

（3）腺病毒相关病毒载体
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是 virus， 一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb， DNA缺陷型病毒 DNA小于 一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb， 无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制 20面体颗粒 不能独立复制， 无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制， 只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒） 只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒） 存在时，才能进行复制和溶细胞性感染， 存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立 溶源性潜伏感染 潜伏感染。 溶源性潜伏感染。
（2）受体介导转移技术
将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联， DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联， 与细胞或组织亲和性的配体偶联 可使DNA具有靶向性。 DNA具有靶向性 可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多 聚阳离子（ 如多聚赖氨酸） 来实现。 聚阳离子 （ 如多聚赖氨酸 ） 来实现 。 多聚 阳离子与配体共价连接后， 阳离子与配体共价连接后 ， 又通过电荷相 互作用与带负电荷的DNA 结合， DNA包围 DNA结合 包围， 互作用与带负电荷的 DNA 结合 ， 将 DNA 包围 ， 只留下配体暴露于表面。 这样形成的复合 只留下配体暴露于表面 。 物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮， 物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮 ， 从 而将外源DNA导入靶细胞。 DNA导入靶细胞 而将外源DNA导入靶细胞。
AAV Virus Particles
AAV的特点 AAV的特点
● 以潜伏感染为主； 以潜伏感染为主； 病毒基因组与细胞共存； ● 病毒基因组与细胞共存； 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于 ● 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于 抑制而维持潜伏状态； 抑制而维持潜伏状态； 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因 ● 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因 表达从而使AAV病毒复制； 表达从而使AAV病毒复制； AAV病毒复制 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞， ● 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞， 建立新的潜伏状态。 建立新的潜伏状态。
（四）自杀基因治疗
自杀基因治疗: 自杀基因治疗 : 恶性肿瘤基因治疗的主 要方法之一。 要方法之一。 原理: 自杀” 基因导入宿主细胞中， 原理 : 将 “ 自杀 ” 基因导入宿主细胞中 ， 这种基因编码的酶能使无毒性的药物前 体转化为细胞毒性代谢物， 体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞 产生“自杀”效应， 产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤 细胞的目的。 细胞的目的。
（五）基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC 通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因 MHC基因 导入肿瘤组织， 导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌 免疫反应。 免疫反应。
二、基因转移 技术
基因治疗的两种途径
靶细胞
ex vivo
载体 பைடு நூலகம்的基因
in vivo
基因转移(gene transfer)技术 基因转移(gene transfer)技术
逆转录病毒
Retrovirus
逆转录病毒介导的基因转移系统
——由两部分组成： 由两部分组成： 由两部分组成 (1) 逆转录病毒载体
辅助细胞株( PA317 317) (2) 辅助细胞株(如PA317)
逆转录病毒载体的特点
逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白， env编码的糖蛋白 ①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许 多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别， 多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 逆转录病毒结构基因gag env和pol的缺失不影响 gag、 ②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响 其他部分的活性。 其他部分的活性。 前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中， ③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于 外源基因在靶细胞中的永久表达。 外源基因在靶细胞中的永久表达。 携带目的基因的重组逆转录病毒载体） ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以 芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中， 芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易 于分离制备。 于分离制备。
AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载 AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载 它对人类无致病性。 体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特 可以高效定点整合至人19 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特 定区域19q13.4 19q13.4中 并能较稳定地存在。 定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶 向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基 因失活和原癌基因激活的潜在危险性， 因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源 基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调 基因可以持续稳定表达， 控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优 点。
腺病毒载体缺点
1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中 1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖 不能整合到靶细胞的基因组DNA 快的细胞，导入的重组病毒载体， 快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢 失的机会增多，表达时间相对较短。 失的机会增多，表达时间相对较短。 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 有两个环节可能产生复制型腺病毒
（二） 基因添加
基因添加或称基因增补（ augmentation） 基因添加或称基因增补（gene augmentation）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达 的基因。 的基因。 类型: 类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因， 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因， 而细胞内的缺陷基因并未除去， 而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常 基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因， 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利 用其表达产物达到治疗疾病的目的。 用其表达产物达到治疗疾病的目的。
1.病毒介导的基因转移系统。 1.病毒介导的基因转移系统。 病毒介导的基因转移系统 2.非病毒介导的基因转移系统 2.非病毒介导的基因转移系统。
1.病毒介导的基因转移系统 1.病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高， 病毒载体介导的基因转移效率较高， 介导的基因转移效率较高 因此它也是使用最多的基因治疗载体。 因此它也是使用最多的基因治疗载体。 据统计， 72%的临床实验计划和71%的 的临床实验计划和71% 据统计，有72%的临床实验计划和71%的 病例使用了病毒载体， 病例使用了病毒载体，其中用得最多的 是逆转录病毒载体。 是逆转录病毒载体。
要实现基因置换， 要实现基因置换 ， 需要采用同源重组技术 使相应的正常基因定向 定向导入受体细胞的基 使相应的正常基因 定向 导入受体细胞的基 因缺陷部位。 因缺陷部位。
定向导入的发生率约 1/100 万 ， 采用胚 定向 导入的发生率约1 100万 导入的发生率约 胎干细胞培养的方法， 胎干细胞培养的方法，这种同源重组的 检出率最高可达1 10。 检出率最高可达1/10。
腺病毒的优点
1.基因导入效率高，对人类安全； 1.基因导入效率高，对人类安全； 基因导入效率高 2.宿主范围广； 2.宿主范围广； 宿主范围广 3.基因转导与细胞分裂无关； 3.基因转导与细胞分裂无关； 基因转导与细胞分裂无关 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸 重组腺病毒可通过口服经肠道吸收 入或气管内滴注； 入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因； 外源基因； 腺病毒载体容量较大
基因治疗的原理
武汉工程大学环境与城市建设学院 采矿工程01班黄杰 采矿工程 班黄杰 二零一零年十一月七号
基因治疗分类
体细胞(somatic cell) 基因治疗 只限于某一体细胞的基 因的改变 只限于某个体的当代
生殖细胞(germline)基 因治疗
对缺陷的生殖细胞进行 矫正 当代及子代
内容提要
（三）基因干预
基因干预（gene interference）: 基因干预（ interference） 采用特定的方式抑制某个基因的表达， 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或 者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达， 者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达， 以达到治疗疾病的目的。 以达到治疗疾病的目的。
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2.非病毒载体介导的基因转移系统 2.非病毒载体介导的基因转移系统
（1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、 脂质体介导的基因转移技术使用方便、 成本低廉。 成本低廉。 基本原理: 基本原理:利用阳离子脂质体单体与 DNA混合后 可以自动形成包埋外源DNA 混合后， DNA的 DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的 脂质体，然后与细胞一起孵育， 脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过 细胞内吞作用将外源DNA 即目的基因） DNA（ 细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因） 转移至细胞内，并进行表达。 转移至细胞内，并进行表达。
(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同 (1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同 源重组； 4.靶向性差 靶向性差。 4.靶向性差。 (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺 (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺 病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。