色谱分析法在药物分析中应用
色谱技术在药物分析中的应用
色谱技术在药物分析中的应用随着药物研究的不断深入，药物分析技术也得到了极大的发展，其中色谱技术是其中的重要方法之一。
色谱技术通过利用物质在不同条件下在固体、液体等介质中的差异，实现对药物的定性和定量分析。
本文将围绕色谱技术在药物分析中的应用进行阐述。
一、药物分析的背景和意义随着国内外医学研究的不断深入，新药研发数量不断增加。
而药物的合成、纯化、稳定性和生物效应等因素会影响药物的疗效和安全性。
为保障人体的健康和生命安全，药物的研究开发过程中，需要对药物进行严格的质量控制和稳定性评估。
药物分析是药物质量评价的核心内容之一。
药物分析可分为药物质量分析、药物稳定性分析、药物纯度分析、药物杂质分析等多个方面。
其中，药物质量分析是药品质量控制的基础，可为药物研发和制造提供可靠的质量指标和控制手段。
药物稳定性分析能够及时发现药物在储存和使用中的变化情况，为制定药物储存和使用标准提供基础数据。
药物纯度分析则能够快速判断药品的质量，确保药品符合质量标准。
二、色谱技术在药物分析中的应用1. 气相色谱技术气相色谱法是一种基于化学物质固、液分离特性的分离技术。
气相色谱技术可用于药物杂质含量分析、药物定量分析等多个方面。
其中，气相色谱-质谱联用技术可用于药物分子结构的确定。
2. 液相色谱技术液相色谱法是一种基于化学物质在溶液中的相互作用特性进行分离的技术。
液相色谱技术广泛应用于药物的定性和定量分析。
例如，药物含量分析、药物纯度分析、药物残留分析等方面。
此外，液相色谱-质谱联用技术还可用于药物的分子识别、化合物定性等方面。
3. 常见的色谱技术在药物分析中，比较常见的色谱技术有高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法（IC）、气相色谱法（GC）、毛细管色谱法（CE）等。
各类色谱技术在药物分析中有各自的特点，具体应用需根据药物的特性和待分析物质的物理化学性质进行选择。
三、色谱技术在药物分析中的挑战及应对措施在药物分析中，色谱技术的应用常受到许多限制。
色谱法在药物分析中的应用
１ 对 已知 化合 物进 行定 性分 析及 结构 鉴定
酯在 ５～５ ０ ｍ ｌ （ ｒ ＝ ０ ． ９ ９ ９ ８ ） 范 围 内线性 良好 ， 加样 回收率 为 ９ ４ ． ７ ％， Ｒ Ｓ Ｄ为 ２ ． ８ ％ 。测 定 结 果显 示 ， ９批 不 同产地 的独 一 味药材 中山栀 子苷 甲酯 的含 量差 异较
（ ６ ０ ：３ ６ ：４ ） 为流 动相 ， 测定 细 辛属及 马 兜铃 属药 材 中
铃 酸 Ａ进样 量 线 性 在 ０ ． ０ １～ ０ ． ２ ５／ ｘ ｇ范 围 内 ， 平 均 回
（ Ｃ） ， 进 行梯 度 洗 脱 ， 结果显示绿原酸、 木 犀 草 素 和 蒙
ｒ ｎ ｌ （ ｒ ＝０ ． ９ ９ ９ ３ ） ， １ ０ ． ５～ ｍｌ （ ｒ ＝０ ． ９ ９ ９ ６ ） 和 １ ． ２～１ ２ ． ０ ｘ Ｉ ｇ ／ ｍ ｌ （ ｒ ＝
种 。另有 ２ ０种 成 分 分 别 为 各 产 地 所 独 有 ， 但 含 量 甚
泛 地应 用 于环境 保 护 、 药 物分 析 、 食品安全、 生 命 科 学 微 ， 其 他 的成分 则 在 ２种 以上产 地上 存在 。
等 领域 。根 据分 离方 法分 为 薄层 色谱 法 、 气 相 色谱 法 、 ２ 对 药 品质 量 的控 制 柱 色谱法 、 高效液 相 色谱法 离 子交换 色谱 法 等 … 。随着
天津 药学
Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ Ｐ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｙ ２ ０ １ ４年
第２ ６卷
第 １ 期
６ ５
色谱法在药物分析中的应用
色谱法在药物分析中的应用【摘要】色谱法在药物分析中扮演着重要的角色。
本文通过介绍液相色谱法、气相色谱法、超高效液相色谱法、色谱联用技术和毛细管电泳色谱法在药物分析中的应用，展示了色谱法在药物分析中的广泛应用和重要性。
本文探讨了色谱法在药物分析领域的未来发展趋势，指出色谱法在药物分析中仍然具有巨大的发展空间和潜力。
通过本文的研究，可以更好地了解色谱法在药物分析中的应用情况及未来发展方向，为药物研发和质量控制提供参考和指导。
【关键词】关键词：色谱法、药物分析、液相色谱法、气相色谱法、超高效液相色谱法、色谱联用技术、毛细管电泳色谱法、发展趋势。
1. 引言1.1 背景介绍色谱法是一种重要的药物分析技术，其应用得到了广泛的认可和应用。
色谱法通过物质在不同条件下的分配和迁移规律，对药物进行分离和检测，具有高效、灵敏、准确的优点。
在药物研究和开发中，色谱法被广泛应用于药物成分的分析、质量控制、药代动力学研究等方面。
1.2 色谱法在药物分析中的重要性液相色谱法在药物分析中的应用主要体现在其在复杂混合物样品的分析上具有很高的分辨率和灵敏度，可以有效分离和测定不同化合物的含量。
气相色谱法则常用于对气体和挥发性有机化合物的分析，具有较高的灵敏度和分辨率。
超高效液相色谱法是近年来发展起来的一种新型色谱方法，其在药物分析中的应用越来越广泛，能够提高分析速度和灵敏度。
色谱法在药物分析中的应用对于确保药物的质量和安全具有重要意义，未来随着技术的不断发展和完善，其在药物领域的地位将会进一步得到强化和拓展。
2. 正文2.1 液相色谱法在药物分析中的应用液相色谱法在药物分析中被广泛应用，其原理是利用不同化合物在流动相和固定相之间的分配系数不同而实现分离。
通过选择合适的流动相和固定相，可以对药物进行高效、快速、准确的分析。
液相色谱法可以用于药物的纯度检验。
通过检测样品中杂质的含量，可以确保药物的纯度符合标准要求，保证药物的质量。
液相色谱法还可以用于确定药物中的主要成分的含量，帮助调整生产工艺，提高药物的制备质量。
药物分析中的色谱技术测定药物纯度
药物分析中的色谱技术测定药物纯度色谱技术是一种广泛应用于药物分析领域的有效方法。
通过分离、检测和定量药物活性成分、杂质和有关化合物，色谱技术能够准确测定药物的纯度。
本文将介绍常见的色谱技术在药物分析中的应用，并深入探讨色谱技术的原理及测定药物纯度的方法。
一、色谱技术在药物分析中的应用1. 气相色谱(GC)气相色谱是一种常用的色谱技术，其运用气体作为载气相，将待测物质分离。
在药物分析中，GC能够精确测定药物中的有机物质，如挥发性成分及有机溶剂残留。
该技术具有分离效果好、分析速度快且准确的特点，因而被广泛应用于药物质量控制和质量评价。
2. 液相色谱(LC)液相色谱是一种基于样品溶解于流动相中进行物质分离的技术。
在药物分析中，LC可用于分离复杂样品中的多个组分，并测定其中药物的纯度。
LC具有广泛的应用范围，包括药物成分分析、药物稳定性研究和药物相溶性研究等领域。
3. 薄层色谱(TLC)薄层色谱是一种常见的简单分离技术，其原理是将待测物质分离于涂层在均匀薄板上的固定相上。
在药物分析中，TLC常用于快速鉴别药物中特定成分的存在以及评估药物的纯度。
由于操作简便、成本低廉，TLC被广泛应用于药物分析实验室。
二、色谱技术的原理色谱技术基于样品成分在固定相和流动相之间的分配行为进行分离。
固定相可为固体或涂覆在固体支持物上的涂层，而流动相则可为气体或液体。
在色谱分离中，样品溶解于流动相中，然后通过固定相，其中成分之间的分配系数不同，使其在固定相中有不同的迁移速度。
通过调节流动相组成和固定相性质，可以实现对药物中各个成分的分离和测定。
三、药物纯度的色谱测定方法1. 直接法直接法是一种常见的测定药物纯度的方法，在这种方法中，将待测药物样品直接注入色谱仪中进行分析。
通过比较药物样品的峰面积或峰高度与标准品进行对比，可以确定药物的纯度。
2. 衍生化法衍生化法是一种将药物样品在色谱前进行化学反应，生成易于分离和检测的衍生体，从而提高色谱分离效果和药物纯度测定的准确性。
色谱法分析技术在药物研究中的应用
色谱法分析技术在药物研究中的应用近年来，随着人们对健康的关注程度不断提高，药品的发展也越来越重要。
药物的研究和生产需要先进的分析技术来验证质量和安全性。
色谱法分析技术作为一种高效、准确、灵敏的药物分析方法，被广泛应用于药物研究中。
本文将介绍色谱法分析技术的基本原理、常见类型以及在药物研究中的应用。
一、色谱法分析技术的基本原理色谱法是一种通过分离混合物中各组分的方法。
其基本原理是使用稳定的相对运动，例如液相和固相、气相和液相、气相和固相等相对运动来达到部分或全部分离混合物中不同成分的目的。
在实际应用中，色谱法的分离效果取决于物理和化学性质的差异。
色谱法分析技术适用于分析含量低、结构复杂的化合物，并且分手性化合物的分离也可以通过色谱法完成。
该分析技术具有操作简单、结果准确、灵敏度高、检测能力强等优点。
因此，它已成为药物研究中被广泛采用的一种分析技术手段。
二、常见类型的色谱法1. 气相色谱法气相色谱法是利用气相柱和薄膜固定相进行，通常需要使用大量的气体作为载流气体。
这种方法适用于描绘挥发性物质的分离和定量，如血浆中的药物。
2. 液相色谱法液相色谱法将混合物溶解在能够分离成分的流动液体之中，并通过与固相进行交互，以使分子组分分离出来。
主要应用于药物精密分子筛和化学分析中，例如药物低浓度分析、毒性分析。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是以固定在固定相表面的离子作为有效分离相，来分离可离性阴离子或阳离子混合物的分析方法。
该方法常用于药物中阴离子或阳离子离子的分离和检测，例如筛查药品中的杂质。
4. 碳氢化合物色谱法碳氢化合物色谱法是以气相柱中的填料作为分离对象，以干燥气体为载流气体，利用流速的快慢，将不同的化学组分分离，适用于分离挥发性物质和固定物质。
三、色谱法在药物研究中的应用色谱法在药物研究中的应用十分广泛。
它通常用于药物分析、结构鉴定，以及反应动力学研究等方面。
1. 药物分析药物的分析是药物研究中最重要的部分之一。
药物分析中的色谱技术应用于药物质量控制
药物分析中的色谱技术应用于药物质量控制色谱技术在药物分析中扮演着至关重要的角色，特别是在药物质量控制方面。
通过色谱技术，我们能够准确测量和分析药物中的各种成分，确保药物的安全性和有效性。
本文将探讨色谱技术在药物分析中的应用，以及其对药物质量控制的重要性。
1. 色谱技术简介色谱技术是一种分离和分析混合物的方法，通过样品溶液在某种载体上的运移速度不同，从而使各种成分分离出来。
常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和超高效液相色谱（UHPLC）。
这些技术基于不同的原理，可以应用于不同类型的药物分析。
2. 色谱技术在药物分析中的应用2.1 药物成分分析药物往往是由多种成分组成的复杂混合物，色谱技术可以对这些成分进行准确的分离和分析。
例如，LC可以用于测量药物中各种活性成分的含量，确保其符合临床使用要求。
GC则可以用于检测药物中的残留溶剂和杂质，保证药物的纯度和质量。
2.2 药物稳定性研究药物的稳定性是指药物在储存和使用过程中是否会发生分解或降解的程度。
色谱技术可以帮助我们定量分析药物在不同条件下的稳定性。
通过测量药物在不同温度、湿度和光照条件下的降解程度，可以确定其最佳储存条件，保证药物质量的稳定性。
2.3 药物含量测定药物的含量测定是药物质量控制中的重要环节。
色谱技术可以准确测定药物中各种成分的含量，并且具有高灵敏度和高选择性。
这对于确定药物的剂量和疗效非常重要。
例如，通过GC测定药物中的活性成分含量，可以确保患者获得正确的药效。
3. 色谱技术在药物质量控制中的重要性药物质量控制是保证药物安全和有效的关键环节。
色谱技术在药物质量控制中的应用可以提供准确和可靠的分析结果，确保药物的质量符合国家和国际标准。
同时，色谱技术还可以帮助识别和鉴定药物中的杂质和不良成分，确保患者的安全。
4. 色谱技术的未来发展随着科学技术的不断进步，色谱技术在药物分析中的应用将变得更加广泛和精确。
例如，液质联用技术（LC-MS）的发展使得对药物中低浓度成分的检测变得更加容易。
高效液相色谱法在药物分析中的应用
高效液相色谱法在药物分析中的应用引言：药物分析是研究药物有关品质、特性和性能的科学，为解决药物的质量控制、卫生监督、疗效评价等问题提供重要依据。
高效液相色谱法（HPLC）作为一种广泛应用的分析技术，被广泛用于药物分析领域。
本文将介绍HPLC的原理、分类、样品前处理以及在药物分析中的应用。
一、高效液相色谱法的原理高效液相色谱（HPLC）是依据溶质在液相中的分配行为，通过使用高压将流动相以高流速通过填充在色谱柱中的填充物，使溶质在液相中迅速地分离和富集的色谱法。
HPLC的关键是：高流速、高效分离柱、高灵敏检测器及自动化数据处理。
其主要原理是利用在流动相动力学不断交互和琢磨下，溶质主动与固定在填充柱中的固定相交互和琢磨而实现分离。
二、高效液相色谱法的分类1. 液相色谱法液相色谱法是利用液相作固定相，将溶质吸附于填充柱的一端的一种色谱法。
根据固定相的种类，又可分为吸附色谱、间隙色谱、离子交换色谱等。
2. 气相色谱法气相色谱法是利用气相作固定相，溶质在气相中沿柱壁表面扩散、交换、迁移分离的一种色谱法。
根据固定相的种类，又可分为草胺酸色谱、膜层分离、毛细管电色谱等。
三、高效液相色谱法中的样品前处理样品前处理在药物分析领域扮演着重要的角色。
在HPLC分析中，如果样品中的杂质较多，可能会干扰分析结果，影响分析的准确性和灵敏度。
因此，合适的样品前处理方法可以减少或消除干扰物，提高分析效果。
常见的样品前处理方法包括前处理、萃取、分配、浓缩、保护性介质法等。
四、高效液相色谱法在药物分析中的应用1. 药物纯度检测HPLC广泛用于药物纯度检测，可以准确测定药物的含量、杂质、有关化合物等。
通过HPLC可以快速、准确地得到药物的质量信息，保证药物的合格出货。
2. 药物稳定性研究药物稳定性对药物的长期储存和使用具有重要意义。
HPLC可以对药物与其他成分的相互作用、不同储存条件下的降解行为进行研究，评估药物在不同条件下的稳定性。
色谱法在药物分析中的应用
色谱法在药物分析中的应用作者：刘翠来源：《科学与技术》2019年第05期摘要：随着人们生活水平的提高，人们提高了对药物的使用要求。
随着我国科技技术的不断提升，色谱法广泛应用于药物分析领域中，能够有效提升分离效能，并且可加快分析速度，同时有较高的专属性，广泛应用于复杂成分分离、药品研发以及质量控制等。
本文就色谱法在药物分析中的应用展开探讨。
关键词：药物分析；色谱法；应用引言随着现代药物分析技术的不断创新和学科交叉的加强，药物分析学势必将得到更迅猛的发展，在新药研发、生产和临床应用等各个方面，药物分析学将发挥所长，解决更为关键的药学科学前沿问题。
1药物分析学科的现状随着21世纪药物科学的迅猛发展，生命科学与药学的融合趋势日益加深，药理学、医学等生物学相关学科的科学问题对药物分析学形成了新的挑战和机遇。
应用现代分析技术和方法，研究药物作用于机体产生的效应及其作用机理，是药物分析学又一个正在拓展的领域，而药物分析学的进一步发展，也需要生物学、医学、理学和工学的技术支撑，呈现明显的学科交叉特征。
众所周知，哪里有药物，哪里就需要药物分析学。
药理学、毒理学、药剂学、药物化学和中药学等学科的发展，都离不开药物分析学。
保障药品质量安全离不开各种药物及其杂质或代谢物的分析方法；各类药物组学（药物基因组学、药物转录组学、药物蛋白质组学、药物代谢组学、药物细胞组学等）研究中，分析和鉴定技术发挥着关键的作用；各类生物标志物的发现和药物的体内过程探究更是需要药物分析学提供高灵敏的分析检测技术。
而药物分析学的发展也离不开相关学科的促进，药学各相关学科对药物分析学学科不断提出更高更新的要求，只有通過与相关学科的深入交叉和合作研究，才能更好地发挥分析方法先行的作用。
2色谱法概述色谱法是现代化学分析中较为重要的一种分析技术，在食品安全、药物分析以及生命科学等领域中应用较为广泛。
此外，色谱法主要分为气相色谱法、薄层色谱法以及高效液相色谱法等，从分离原理角度分为分配色谱法、吸附色谱法以及离子交换色谱法等。
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色谱分析法在药物分析中的运用气相色谱法测定丁香药材中丁香酚的含量丁香Eugenia caryopbllata Thunb．药材来源于桃金娘科植物的干燥花蕾，收载于中国药典1995年版一部。
在95版药典中，丁香药材的音量测定只收载了测定挥发油音量的方法，但没有测定挥发油中丁香酚(C10H12O2)的音量。
为进一步控制和考察丁香药材中丁香酚的音量，我们分别采用了浸溃法和挥发油提取法，提取后用气相色谱法分别来测定丁香药材中丁香酚的音量。
1 仪器与试砖GC-9A 和GC-14B气相色谱议(日本岛津)。
10%PEG-20M 色谱柱。
丁香酚耐照品购自中国药品生物锚品检定所(批号：725—8802)，经标化其音量为98%以上，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果2 1 色谱条件厦系统适用性试验：色谱柱：lO%PEG-20M，检测器FID，N2：60kPa，柱温：180℃，进样口温度：250℃，衰减2。
在上述条件下丁香酚峰与其它组分峰均能达到基线分离，且出峰对间较快，峰形较好，阴性样品无干扰。
吸取上述对照品溶液1μL，注人气相色谱仪，结果理论塔板数n> 1200。
拖尾因子在0.95～1.05之间，校正因子的相对标准偏差小于2.0%。
2．8 供试品和对照品溶液的制备2．2 1 提溃时间的确定：在试验研究中比较了不同浸渍时同丁香药材中丁香酚的含量。
上述结果表明，浸渍24 h以上，丁香药材中的丁香酚已浸渍完全。
2．2．2 供试品溶液的制备：取本品粗粉约0.6g，精密称定，量具塞锥形瓶中，精密加入乙醇2OmL，称定重量，摇匀t宣温放量24h以上，再称定重量，补足损失重量，振摇后放量，用滤纸滤过。
精密量取滤液5mL，量25mL的容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，作为供试品溶液。
2．2 3 对照品溶液的制备：精密称取对照品适量，加无水乙醇溶解，制得0.492 mg／mL 的溶液，作为对照品溶液。
2．3 线性范围的考察分别精密吸取上述对照品溶液0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、4、5μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵座标，丁香酚音量为横座标，计算得回归方程Y= 9.26×10000X一35.94，r=0.9999，表明丁香酚在0.246～2.46ng具有良好的线性关系。
2．4 精密度试验：精密吸取丁香酚对照品溶液1μL，重复进样6次，结果测得平均峰面积为151654，RSD为1.3%。
2. 5 重现性试验：取同一批药材5份，按丁香酚音量测定方法操作，结果丁香酚音量的平均值为121.02mg／g，RSD 为0.7%。
2．6 回收率试验：采用加样回收法，精密称取已知音量的丁香药材0.1 g(每克药材吉丁香酚121.6mg)，分别加对照品适量，按音量测定方法试验，结果平均回收率为98.6％，RSD为0.5%。
2．7 样品音量的测定分别取不同来源的5批丁香药材，按吉量测定方法试验，分别测定丁香酚的含量。
3 小结实验结果表明，采用浸溃提取法比挥发油提取法简便、可控和准确，可以作为该药材的质量检控指标之一。
HPLC-ELSD在药物分析中的应用1、在天然药物及复方成药分析中的应用ELSD能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品，天然产物中的许多成分无疑找到了直接、准确的测定方法。
ELSD在天然产物及其复方成药分析中的应用报道主要有皂苷类、生物碱类、萜类内酯等。
皂苷无紫外吸收或仅为末端吸收，ELSD能够对其不经衍生进行检测，在HPLC—ELSD的应用中这方面的报道最多。
主要有一次性分离分析天然人参、生脉散复方、育精胶囊中的多种人参皂苷；西洋参中的人参皂苷和拟人参皂苷定量测定；三七中的三七皂苷的含量分析；黄芪、黄芪注射液和保元汤中的黄芪皂苷、黄芪甲甙的分离和测定；麦冬中的甾体皂甙元；天麻中的天麻甙的含量测定等。
这些研究主要采用Cl8柱、乙晴与水作流动相，不经衍生直接测定多组分含量，结果显示方法灵敏度高(一般检测限低于3μg／m1)、线性关系良好。
对于无紫外吸收的生物碱类成分，ELSD 同样显示出操作简单、灵敏度高的优点。
对比HPLC—UV法测定贝母中的甾类贝母生物碱，采用ELSD检测器，不但不需衍生化操作，提高了结果的准确度，而且可检测出不含双键的贝母甲素，对动物体内的生物碱类成分如河豚毒素，无紫外吸收且安全性低，不适合衍生化法，可用ELSD法进行检测，获得满意结果。
银杏作为一种保健药品，其主要活性成分为黄酮类和萜类内酯，以往银杏中的萜类内酯成分主要采用HPLC—UV法和HPLC—RI测定，但由于萜类内酯紫外吸收差，又含少量物质的干扰，结果稳定性和准确性较差．随着ELSD的发展和普及，这些方法已经逐渐被ELSD法所取代。
2、在抗生素分析中的应用HPLC—ELSD早在20世纪九十年代就用于天然产物分析，随着技术的发展，其应用范围已逐渐扩大，近年来屡有用HPLC—ELSD分析抗生素类药物的报道，HPLC—ELSD分析抗生素类药物的报道多见于氨基糖苷类抗生素、氨基糖苷类抗生素是临床上常用的抗生素，可通过微生物发酵或半合成制得，是一类单组分或多组分糖基取代的氨基环醇类化合物，主要有：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、小诺霉素等。
对这一类抗生素的含量测定多采用微生物法，但微生物法测定的是各活性组分的总量，无法反映各组分组成。
为克服这个缺点，国内外的药典采用HPLC法进行测定，但这类抗生素无紫外吸收，只能采取衍生化法(多为柱前衍生)，结果易受衍生化反应条件的影响而不够准确，ELSD法很好地解决了这个问题。
氨基糖苷类抗生素含多个氨基，可产生含不同当量无机酸盐产品，对于这些副产物成分，ELSD也能很好的加以测定。
高效液相色谱- 荧光衍生法在体内药物分析中的应用体内药物分析是在大量复杂组分中进行微量或超微量药物及代谢产物的测定。
体内药物分析最常用的检品是血样(血浆、血清、全血)、尿样、唾液及组织液, 特殊情况下也采用乳汁、泪液、胆汁、羊水、粪便等[1]。
随着药物的开发研究, 药物的服用剂量越来越小, 体内药物的浓度越来越低, 这对分析方法灵敏度和选择性等都提出很高的要求[2]。
高效液相色谱法具有准确、灵敏度、专一性强等特点, 一直是体内药物分析的主要手段[3]。
而高效液相色谱的荧光检测器比紫外吸收检测器灵敏度高。
具有强紫外吸收的化合物检测灵敏度可达ng水平, 而荧光衍生物一般的检测水平为10-12～10-14m ol/L,灵敏度比紫外检测器提高10～1000 倍[4]。
故H PLC 法结合荧光检测法所具有的较高的选择性及灵敏度以及试样用量少的特性, 使得对复杂生物样品中药物及其代谢物的测定变得更加灵敏、准确、快速。
但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光. 对于不产生荧光或荧光较弱的样品灵敏度很低, 甚至不能检测。
为了扩大检品范围, 提高检测灵敏度, 常采用荧光衍生法。
荧光衍生法是指在一定条件下利用某种试剂与样品中待测组分相作用, 使其产物具有荧光或荧光增强。
另外,荧光检测器选择性好, 过量的试剂和副产物往往不产生干扰, 衍生物亦不必纯化, 因此荧光衍生技术的采用, 扩大了高效液相色谱- 荧光测定法在体内药物分析中的应用范围, 为药物代谢动力学, 临床药理学和毒理学等研究提供科学依据。
荧光衍生化反应根据衍生反应的场所来分, 有柱前衍生化(pre-colum n derivatization), 柱上衍生化(on-colum n derivati-zation)和柱后衍生化(post-colum n derivatization)三种. 从是否与仪器联机的角度来分有: 在线(on-line)、离线(of-line)和旁线(at-line)(自动化)三种. 目前在H PLC 中以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多. 旁线衍生化方法是发展方向[5]。
1 衍生化试剂常用的荧光衍生化试剂有: 荧光试剂和荧光染料荧光胺(fluorescam ine, 又名胺荧) 、邻苯二甲醛(O-phthaldehyde) 、丹酰氯(dansylchloride, DNS-Cl)、氯化硝基苯骈氧二氮茂(NBD-chloride)、等。
荧光胺是一常用荧光衍生化试剂, 可同伯胺及大多数氨基酸反应, 反应迅速, 衍生物具有高荧光强度的吡咯啉酮, 而试剂本身则迅速水解为不发荧光的产物, 是一理想的柱前衍生化试剂; 丹酰氯是应用最广的荧光衍生试剂, 常用于含氨基药物的测定, 同伯胺和仲胺都能反应, 还可用于含酚羟基药物如雌激素的测定; 邻苯二甲醛, 常用于伯胺类及α- 氨基酸类化合物的荧光分析。
胺类化合物的衍生试剂还有荧光素异硫氰酸酯(FITC) 、芴代甲氧基酰氯(FM OC) 、4- 氯-7- 硝基-2,1,3- 苯骈恶二唑( NBD-C) 、l6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯(AQC) 等[6～10]。
目前已开发出一些醇和酸的衍生化试剂[11～13]。
醇、酚的衍生试剂有: 羰基氯类(FM OC、CEOC) , 氯甲酸芴甲酯(FM OC-C1); 磺酰氯类(DNs-Cl) , 卤代三嗪类有:1- 乙氧基-4- (二氯- 三嗪)萘(EDTN ) ; 羧酸类化合物的衍生试剂有: 4- 溴甲基-7- 甲氧基香豆素(BrM M C) , 7-N- 哌嗪-4- 二甲氨基苯骈呋喃重氮(DBD-Pz) 、9- 蒽重氮甲烷(ADAM ) 、4- 氨甲基-6, 7- 二甲基香豆素(ADM C)、9-(2- 羟乙基)- 吖啶酮(H EA ) 等。
羰基化合物的衍生试剂有肼类: DNs-H 、CEOC-H , 氨基类有氨基甲基芘等。
另外, 还有些化学试剂可利用化学反应使一些自身不能产生荧光的化合物转变成荧光化合物。
这可能是由于化学反应增加了π电子共轭系统的长度或增加分子结构的刚性和共平面性所致。
常用的化学反应有氧化还原反应、水解反应、缩合反应、络合反应、光化学反应等。
比如维生素B1 可在碱性溶液中被K3Fe(CN)6 氧化成具有荧光的硫色素, 氨苄青霉素在酸性溶液中(pH =2),以甲醛为催化剂, 90℃加热 2 小时,水解成强烈黄色荧光的化合物。
2 生物样品的前处理生物样品中的药物在检测前, 首先应除去蛋白质的干扰, 保证色谱柱的柱效和寿命。
去除蛋白质常用的方法有⑴加入沉淀剂和变性试剂, 如硫酸铵、硫酸钠等中性盐、强酸和重金属盐等; ⑵加入可与水混溶的有机溶剂, 如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃等。
经有机溶剂或酸处理后的生物样品与反相H PLC 分析相匹配。
应用反相H PLC 时生物样品甚至可以不用有机溶剂萃取, 可将含药的液体样品直接进样或经过简单的去蛋白后进样, 操作简单, 所以应用前景甚为广泛[14]。