电镜取样及固定液配制

细菌及细胞电镜观察样品制备方法

细菌及细胞电镜观察样品制备方法
1) 取样：取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。

2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。

再用纯水清洗两遍。

3) 梯度脱水：用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2 次；再将样品置于乙醇与叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。

（此步也能够尝试不做）4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

5) 电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

2.5%戊二醛：
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4。

电镜观察固定方法

电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。

若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min 50%10min 70%10min 到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min 90%15min 95%15min 100%30min 100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min 环氧丙烷20min 包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。

（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）。

电镜步骤

生物医学测试中心细胞生物学平台电镜机组常规透射电镜样品处理步骤1. 取新鲜的足够小的样品立刻置于pH=7.2的固定液（含2%PFA和2.5%的戊二醛的混合液）中，4°C过夜或者室温固定2h以上。

2. 0.1M的PB缓冲液冲洗样品3次，10min/次。

3. 1%饿酸后固定1h。

4. 0.1MPB缓冲液冲洗3次，10min/次。

5. 梯度酒精脱水，50%，70%，80%，90% 10min，100%酒精3次，10min/次。

6. 酒精：丙酮=1:1 10min。

7. 丙酮10min。

8. 丙酮：812树脂=1:1 2h，RT9. 丙酮：812树脂=1:2 2h，RT10. 丙酮：812树脂=1:3 2h，RT11. 树脂过夜。

12. 更换新鲜树脂8h。

13. 包埋样品，RT静置4h。

.14. 37°C过夜。

15. 60°C24h。

16. 制作超薄切片。

17. 电镜观察拍照。

注意事项：1. 如有条件对实验动物用混合固定液（（含2%PFA和2.5%的戊二醛的混合液）进行灌流（perfusion fixation），或者在低温环境下用锋利的切割器械迅速取材。

2. 动作迅速：组织离体后应尽快将其快速放入化学固定液内，使组织和细胞尽可能保持原来的生活状态。

3. 减少损伤：选择锋利切割器械，避免或尽量减少牵拉或挤压组织。

4. 组织块大小：为使组织得到均匀而充分固定，所取材料应小于1mm³。

5. 低温操作：为减少对组织细胞酶活性的破坏，最好在4℃下操作，所用容器、器械及固定液均需要预冷。

在血液供给停止后，防止组织和细胞内各种酶的作用使组织发生自溶，降解组织中蛋白、核酸等主要成分。

6. 需要定位样品请与相关人员咨询特定取材方式。

常见样品脱水时间：细胞8min组织10min,若较嫩为8min细胞器2min脂肪8min或＜8min叶片15min根15min藻类15min菌10-15min以上均为常规注意事项，送样之前和送样时请与相关人员当面进行沟通，然后选择适合的处理方法。

电镜生物样品前处理固定液配方

固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g加双蒸水至100mlB液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液Na2HPO4•2H2O 35.6gNa2HPO4•4H2O 53.63gNa2HPO4•7H2O 71.64g100mlB液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml二、四氧化饿固定液1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml2%四氧化饿水溶液5ml三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g双蒸水20ml2、固定液配制0.2M磷酸缓冲液50ml25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml10%多聚甲醛水溶液20ml染色液配方一、超薄切片染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g柠檬酸三钠 1.76g切片染色时间5-10min 双蒸水30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g50%乙醇100ml切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。

二、负染色液1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g双蒸水100ml2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀双蒸水3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g双蒸水。

扫描电镜细菌制样方法

细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。

(1)收集菌体:①液体培养基中的菌体,可取培养液8000rpm离心3~5min,弃上清,倒入2.5%戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体,可在菌落外表滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落(注意不要刮下培养基)。

将菌液吸入小离心管,离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2)固定,脱水按常规方法。

2.5%戊二醛,2~4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4~6h→缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次(注意:每步均需离心,8000rpm,3~5min,弃上清,倒入下一种试剂,滴管来回吸几下,打散菌块)。

(3)临界点枯燥: 普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份,对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状。

将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。

放入临界点枯燥器样品室,进展CO2临界点枯燥。

一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意,需用液态CO2置换2~3次)。

(4)离子溅射金:沿两端书钉剪开滤纸包,将枯燥后粉末状纯菌体倒入平皿,轻摇尽量分散菌体。

碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上,另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。

离子溅射金后,即可进展扫描电镜观察。

细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌。

然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内参加适量1%锇酸，盖上含有样品的瓶盖，熏蒸固定2h以上。

然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进展扫描电镜观察。

2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min，弃上清液，参加2.5%戊二醛固定2h，pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗，然后参加蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。

电镜观察固定方法

电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。

若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min 50%10min 70%10min 到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min 90%15min 95%15min 100%30min 100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min 环氧丙烷20min 包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。

（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）。

电镜材料固定方法

1、固定液固定（固定液体积是固定材料的十倍以上）
3%戊二醛in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
（取材：先整个材料放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成小块后1*1mm，置于固定液中，抽气~20min，让材料沉入固定液中）
2、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3、1%锇酸固定in 0.1M PBS，4°C overnight
4、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5、乙醇系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）
-80%-90%-95%-100%-100%（每级20-30分钟，不同材料时间不同）
注意：100%乙醇时不要吸干，防止材料干了。

用丙酮置换乙醇：
乙醇：丙酮=1：1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6、丙酮：树脂=2：1，1：1（可以停下了，overnight），1：2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始就要防潮！）
7、包埋
8、聚合60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in 0.1M PBS Ph 7.2。

扫描电镜样品制备程序

扫描电镜样品制备程序一、固定：戊二醛-锇酸双固定法1．2.5%戊二醛（试剂1）固定4小时（或者过夜）2．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15-30分钟3．1%锇酸（试剂3）固定2-4小时4．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15分钟二、脱水：乙醇系列1．30%乙醇15－20分钟2．50%乙醇15－20分钟3．70%乙醇15－20分钟4．80％乙醇15－20分钟5．90%乙醇15－20分钟6．95%乙醇15－20分钟7.100%乙醇两次每次15-20分钟三、置换：乙酸异戊酯2次，每次15分钟（或过夜）。

四、干燥：临界点干燥五、离子溅射金六、扫描电镜观察附注：试剂配置试剂1：2.5%戊二醛取0.2M磷酸氢二钠40.5mL（A液），0.2M磷酸二氢钠9.5mL（B液），混合均匀（即0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4），加入10mL浓度为25%的戊二醛，用超纯水稀释至100mL。

试剂2：0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）A液：0.2M磷酸氢二钠称取3.561g Na2HPO4.2H2O（或者5.365g Na2HPO4.7H2O）; 或7.164g Na2HPO4.12H2O)，溶于100mL双蒸水中。

B液：0.2M磷酸二氢钠称取2.760g NaH2PO4.H2O（或者3.121g NaH2PO4.2H2O），溶于100mL双蒸水中。

量取A液36.0mL, B液14.0mL，混合均匀后用双蒸水稀释至100mL，得0.1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。

试剂3：1%锇酸将2%的锇酸溶液与0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）等体积混合，得1%锇酸。

注意：该操作在通风橱中进行。