外周血循环肿瘤细胞检测
肺癌患者外周血循环肿瘤细胞检测结果分析
92Internal Medicine,Feb.2021,VoL16,JVb・]•调查与分析•肺癌患者外周血循环肿瘤细胞检测结果分析麦春平唐慧妍林丽湘肇庆市第一人民医院肿瘤科，广东省肇庆市526000【摘要】目的探讨肺癌患者外周血循环肿瘤细胞检测结果与患者临床特征、治疗效果以及预后的关系，为肺癌的临床诊治和患者预后判断提供参考。
方法选取我院肿瘤科2016年7月到2017年12月收治的肺癌患者60例为研究对象，采用免疫磁珠阴性富集法检测患者外周血循环肿瘤细胞(CTC);根据CT检查结果，参照RECIST 标准评定患者治疗效果,对治疗前后肺癌患者CTC数量增减与疗效的关系进行Spearman秩相关分析；比较CTC阳性和阴性患者的1年及2年生存情况。
结果60例肺癌患者中，CTC阳性41例,CTC阳性率为6&33%。
CTC阳性患者和阴性患者的年龄、肿瘤最大直径和临床分期比较差异有统计学意义(P<0.05)o化疗1个月后，CR患者5例、PR患者19例、PD患者28例、SD患者8例；Spearman秩相关分析结果显示，患者的CTC数量变化与其疗效呈负相关(r=-0.412,P<0.05)。
CTC阳性和阴性患者的1年生存率比较差异无统计学意义(P>0.05),但CTC阳性患者的2年生存率显著低于阴性患者，差异有统计学意义(P<0.05)o结论肺癌患者的CTC数量及变化与患者的临床特征、治疗效果以及预后均存在一定的关系，对临床治疗和判断患者预后具有一定的参考价值。
【关键词】肺癌；外周血循环肿瘤细胞;预后【中图分类号】R563；R734.2【文献标识码】DOI：10.16121/45-1347/r.2021.01.28肺癌是临床最为常见的恶性肿瘤,好发于中老年群体,具有发病率高、致死率高的特点,存活者预后较差,是当前影响人类健康的主要恶性肿瘤⑴。
近年来，随着人口老龄化以及生态环境污染加重、吸烟人群的增加,人群肺癌发病率逐年上升,并呈现出一定的年轻化趋势，肺癌防治形势异常严峻，因此加强对肺癌的早期检测，对改善患者预后具有重要的意义⑵。
外周血循环肿瘤细胞(CTCs)分离富集检测及其临床应用
仅能揭示瞬时的基因组特征 不可行 无 58%（肺癌）
49.6%（肺癌）
97.2%（肺癌） 未见报道 不可以 不可以 数据质量较差
CTC检测助力肿瘤诊疗
2 最具潜力的液体活检---CTC检测
7
2.1 CTC概念
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
03 非典型形态
• CTC入血后随血液快速流动。 • 与其他细胞碰撞、受到血管壁 的挤压。 • 受机体免疫系统以及药物的攻 击。 • CTC形态有别于肿瘤组织、细 胞大小、形态及表型发生变化。
瘤标志物
Weinberg提出CTC 可作为具有临床实 践价值的诊断指标， 为临床提供重要信
息
CTC的EMT状态与 肿瘤治疗效果和复
发相关
CFDA批准叶酸受 体阳性CTC检测试
剂盒
1869 1889
1976
1982
2004
2007 2008
2011
2012
2013
2014
2016 2017
提出“种子与土壤”假说， 即肿瘤细胞可随血液在 体内循环，进入其他器 官如同种子遇到土壤，
03 非典型形态
•相同肿瘤的不同细胞之间的基因 与表型存在差异。
• 不同实体肿瘤来源CTC，不同患 者CTC表面抗原表达、分布存在差 异。
Burrell RA, et. al. Nature. 2013 ;501(7467):338-45.
2.3 循环肿瘤细胞特点---非典型形态
01 稀有性
02 异质性
优点：非侵入式； 无创； 可重复性取样； 获取全面的疾病信息。
Alix-Panabières C, Pantel K. Clin Chem. 2013 Jan; 59(1):110-8.
人外周血循环肿瘤细胞(CTC)
人外周血循环肿瘤细胞(CTC)检测技术的研发及临床应用开发美国肿瘤协会于2006 年发表的年度报告指出，目前全世界范围内每3 人中就有1 人在其一生中会患有某种肿瘤，而且肿瘤发病率在发展中国家随着污染程度的增加，患病几率还会高于1/3 的比例。
现今全世界用于肿瘤治疗与防治的费用每年以16.5% 的比例递增。
仅用于乳腺癌，结直肠癌及前列腺癌（还不包括发病率最高的肺癌）的投资，目前世界范围内已达每年92 亿美元。
目前全世界用于肿瘤诊断的方法可归为三大类：病理学（活检切片）；影像学（超声，X光，CT, PET 等）和血清学（血清肿瘤相关蛋白，如CA-125, CA-199, CEA 等），但所有这些方法都有不可避免的缺点，例如灵敏性及特异性差，过于依赖医生判断的主观性等。
因此目前临床急需一种能够为医生及病人提供准确，快速的肿瘤检测手段。
经过长时间的大量研究，美国FDA 认证的人外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）检测目前已被公认为最好及最可观的检测手段之一。
目前已有越来越多的国内外医生开始应用此技术作为肿瘤检查的重要辅助手段。
不仅于此，CTC 检测也被公认为是目前国外新近流行的肿瘤治疗方法-即阻断肿瘤细胞入血转移的唯一有效检测指标。
除了上述CTC可作为肿瘤检测手段外，CTC还可成功应用于以下一系列其它方面的用途：(1)个体化治疗的体外肿瘤药物筛选；(2)体内化疗药物药效的快速评估: 相对于每12周一查的CT 诊断，CTC在第1-2周即可显示药效结果，这一点对临床医生和病人尤为重要；(3) 根据CTC数目，判断病人愈后状况及存活时间；（4）肿瘤病人复发的监测与及时诊断；及（5）正常人群体检普查以利于尽可能的肿瘤早期诊断。
除了应用于临床外，CTC 亦可应用于众多药厂和科研机构的基础研究，包括寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物等。
目前美国FDA已于2004年认证了美国上市公司Immunicon/Veridex的CTC检测技术及其临床应用。
外周血叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测在非小细胞肺癌筛查中的应用价值
•论外周血叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测在非小细胞肺癌筛查中的应用价值唐兴.蒋东，赵军苏州大学附属第一医院胸外科，江苏苏州215006摘要：目的观察非小细胞肺癌患者外周血叶酸受体阳性循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, C T C s)水平变化，探讨外周血叶酸受体阳性C T C s在非小细胞肺癌筛查中的应用价值。
方法非小细胞肺癌患者136例为肺癌组，肺部良性病变患者10例为良性病变组，健康志愿者54例为对照组。
3组均采用以叶酸受体为靶点的免疫磁珠阴性富集+实时荧光定量P C R法检测外周血叶酸受体阳性C T C s水平；采用化学发光免疫分析法检测血清癌胚抗原（carcino-embryonic antigen. C E A)、糖链抗原（carbohydrate antigen. C A)125、C A724、细胞角蛋白19 片段（cytokeratin 19 fragment，C Y F R A21-1)、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，N S E)水平。
比较3组C T C s水平；比较不同临床特征非小细胞肺癌患者C T C s水平;绘制R O C曲线，评价C T C s及血清C E A、C A125、C A724、C Y FR A21-1、NSE 5项指标联合诊断非小细胞肺癌的价值。
结果肺癌组C T C s水平[11. 21 (8. 58,15. 30) F U/3m l j高于良性病变组[7. 55 (5. 23，10•25)F U/3m L]和对照组[4.95(3•55,7•62)F U/3m L](；：)<0•05),良性病变组高于对照组（P<0•05)。
T N M分期I、II、丨H、W期非小细胞肺癌患者CTCs 水平[11. 00(8. 58,13. 30)、13. 25(10. 48,16. 88)、14. 77( 11. 47,16. 55)、17. 89(17.07.19.22)F U/3m L]两两比较差异均有统计学意义（幵=〗6.443./3<0.05);不同年龄、性别、肿瘤最大径、丁分期、分化等级、病理类型非小细胞肺癌患者C T C s水平比较差异均无统计学意义（P>0.05),R O C曲线分析结果显示，C T C s以8. 70 F U/3m L为最佳截断值，诊断非小细胞肺癌的A U C为0. 953(95%t7:0.926〜0. 979,P<0.05),灵敏度为79.40%,特异度为98.10%,诊断效能优于〔[六、(：八125、(：八724乂'丫？1^21-1、>«£联合检测。
循环肿瘤细胞(CTC)检测
循环肿瘤细胞（CTC）检测一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。
CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。
大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。
二、肿瘤的发生及检测诊断全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。
然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。
美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。
因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。
我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。
伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。
传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。
晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。
在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。
临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。
如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。
肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。
如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。
外周血循环肿瘤DNA检测方法及应用
ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｌ ｅ ｖ ｅ １ ．Ｇｅ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｉ ｓ ｃ ｒ ｕ ｃ ｉ ａ ｌ ｉ ｎ ｈｅ ｔ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ ｐ ｒ ｏ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｕ ｍｏ ｒ ．Ｅａ ｒｌ ｙ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ
ｈ ａ ｓ ｂ ｅｅ ｎ ｐｒ ｏ ｖｅ ｄ ｔ ｏ ｂｅ ｔ ｈｅ ｍ ｏ ｓ ｔ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｗ ａ ｙ ｔ ｏ ｉ ｍｐ ｒ ｏｖ ｅ ｔ ｈｅ ｓ ｕ ｒ ｖ ｉ ｖ ａ ｌ ｒ ａ ｔ ｅｓ ａ ｎｄ ｄ ｅ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｅ ｔ ｈｅ ｍ ｏ ｒ ｔ ｌｉ ａ ｔ ｙ ｏｆ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｐ ａ ｉｅ ｔ ｎｔ ｓ ． Ｔｅ ｓ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｇｅ ｎ ｅ ｍ ｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｓ ｉ ｎ ｔ ｈｅ ｃ ｉ ｒ ｃ ｕｌ ａ ｉｎｇ ｔ ｔ ｕｍ ｏ ｒ ｉ ｎ ｐｅ ｉｐ ｒ ｈｅ ｒ ｌ ｂｌ ａ ｏ ｏｄ ｗ ｅ ｒ ｅ ｔ ｈｅ ｓ ａ ｍｅ ａ ｓ ｗｈ ａ ｔ ｉ ｎ ｔ ｕ ｍ ｏｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ． Ｔｈｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈｅ ｓ ｅ ｇｅ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｉｏ ｔ ｎｓ ｍ ａ ｙ ｐｒ ｏ ｖｉ ｄ ｅ ａ ｂｕ ｎｄ ａ ｎｔ ｉ ｎ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏｒ ｈｅ ｔ ｓ ｔ ａ ｇ ｉ ｎｇ ｏｆ ｔ ｕｍｏｒ ｎｄ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ｐｅ ｕ ｉｃ ｔ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｎｄ ｐｒ ｏ ｇ ｎｏｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｄ ｒ ｕ ｇ． Ｈｅ ｎ ｃ ｅ， ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｉｎ ｔ ｇ ｏ ｆ ｔ ｕｍ ｏ ｒ — ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｍｕ ａｔ ｔ ｉ ｏｎ ｉ ｎ ｃ ｉ ｒ ｃ ｕｌ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ＤＮＡ ｉ ｎ ｐｅ ｒ ｉ ｐｈ ｅ ｒ ａ ｌ ｂｌ ｏｏ ｄ ｐ ｒ ｏｖ ｉ ｄ ｅ ｓ ｎｅ ｗ ｄｉ ｒ ｅ ｃ ｉｏ ｔ ｎ ｆ ｏｒ ｔ ｕｍ ｏ ｒ ｅ ｒｌ ａ ｙ— ｓ ｔ ａ ｇｅ ｄ ｉ ａ ｇ ｎｏ ｓ ｉ ｓ ａ ｎｄ ｈｅ ｔ ｒ ａ ｐｙ．
实时荧光定量PCR检测外周血循环肿瘤细胞的研究
实验讨论
实时荧光定量PCR技术的实验结果准确可靠，但也存在一些争议。其中之一 是引物特异性问题，如果引物与非目标序列发生交叉反应，将导致实验结果的偏 差。另一个问题是荧光信号的干扰，可能会影响实验结果的准确性。为确保实验 结果的可靠性，可以通过设计特异性强的引物、选择高质量的试剂和优化实验条 件等措施来降低误差。
研究现状
实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应过程中加入荧光基团，通过荧光信号 的积累对PCR产物进行实时检测的方法。近年来，该技术在外周血循环肿瘤细胞 检测领域取得了重大进展。国内外学者针对不同的肿瘤类型，对实时荧光定量 PCR技术进行了方法学研究和应用探索。例如，Liu等建立了针对结直肠癌细胞的 实时荧光定量PCR检测方法，并成功应用于临床样本的检测。
2、计算拷贝数：通过比较已知标准品和未知样品的荧光信号强度，可以计 算出未知样品中目标DNA的拷贝数。
实时荧光定量PCR技术在科学研究和工业生产中具有重要的应用价值。例如， 该技术可用于研究基因表达差异，比较不同组织或不同个体之间的基因表达谱； 还可用于检测基因突变和遗传疾病，如地中海贫血、囊性纤维化等疾病；此外， 实时荧光定量PCR技术还广泛应用于病毒检测和定量分析，如HIV、HBV等肝炎病 毒、SARS冠状病毒等。
参考内容
实时荧光定量PCR技术是一种在生物医学领域广泛应用的技术，主要用于检 测和定量DNA分子的数量和浓度。该技术的出现和发展，使得科研人员能够更准 确、快速地研究基因表达、遗传变异等相关问题。本次演示将详细介绍实时荧光 定量PCR技术的原理、实验流程、结果分析和应用实例，以期让更多人了解这一 重要的生物技术。
பைடு நூலகம்
方法与材料
实时荧光定量PCR技术的主要步骤包括引物设计、反应体系构建、数据采集 和分析等。在引物设计时，需要选择特异性强的引物，以避免非特异性扩增和交 叉反应。反应体系构建包括DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶和荧光染料等组分的 添加和混合。数据采集主要通过荧光信号的强度和PCR产物的量之间的关系来实 现定量分析。
外周血循环肿瘤细胞检测的研究进展
般 而 言 ，Ｔ Ｃ Ｃ检 测 的方 法 大 致 可 以分 为 细 胞 计 数 和 基
【 关键词 】 循环肿瘤细胞 ； 肿瘤标 志物 ； 肿瘤 转移 ； 检测技术
中 图 分 类 号 ：７ ３ Ｒ ３ 文 献 标 识 鹤 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ９— ４ ０ ２ １ ）０— ９４— ４ １０ ０ ６ （０ ０ １ ０ ４ ０
Ａ ｄ ａｎ ｅ ｉ ｈ ｔ ｃ ｉ ｆｃ ｒ ｕｌ ｔｎｇ ｔ ｍ ｏ ｅｌ ｎ ｐｅ ｉ ｖ ｃ ｎ ｔ ｅ ｄｅ ｅ ｔｏｎ ｏ ｉｃ ａ ｉ ｕ ｒ ｃ ｌ ｉ ｒｐｈｅ ａ ｏ ｄ ｓ ｒ ｌｂｌ ｏ
恶 性 肿 瘤 严 重 威 胁 人 类 健 康 ， 致 死 的 主 要 原 因是 部 分 其
类 型 和分 子 表 型 的 肿 瘤 分 别 表 达 不 同 的 标 志 物 ； 外 ， Ｔ 此 ＣＣ 在 外 周 血 中数 量 稀 少 ， 般 在 １。一１ 白细 胞 中 仅 含 有 １ 一 ０ ０个 个 。 目前 广 大 肿 瘤 研 究 人 员 特 别 关 注 的 是 如 何 找 到 Ｃ Ｃ的 Ｔ 特 异 性 标 志物 并 提 高检 测 手 段 的敏 感 性 和 特 异 性 。
一
肿瘤 细胞获得侵袭 能力并 造成 远处转 移 。肿瘤转 移是一
个 涉及 多 步 骤 多 因素 的 复 杂过 程 ， 有 转 移 潜 能 的 肿 瘤 细胞 具 脱 离原 发病 灶 ， 极 少 的数 量 转 移 到 血 液 、 髓 、 巴结 或远 以 骨 淋 处 器 官 中 ， 用 常 规 的 检 测 手 段 难 以发 现 ， 为 肿 瘤 的 微 转 使 称 移 （ ｃｏ ｅ ｓ ｓ ） 肿 瘤 细 胞 的 脱 落 、 袭 并 进 入 血 液 循 Ｍｉ ｍ ｔ ｔ ｉ 。 ｒ ａａｓ 侵 环 是 实 现 肿 瘤 转 移 的 最 初 阶 段 ， 为 最 终 形 成 肿 瘤 转 移 病 灶 并 提供了可能 ， 因此 在 外 周 血 中 检 测 循 环 肿 瘤 细 胞 （ ｉ ｕ ｔ ｇ ｃ ｃｌ ｉ ｒ ａｎ
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4.6
0.505 (0.417-0.592)
32.3
0.716 (0.615-0.816)
12.3
0.624 (0.535-0.713)
? 天津市肿瘤医院 ? 成都大学附属医院 ? 重庆市肿瘤医院 ? 苏州大学第一附属医院 ? 西安交大一附院 ? 陕西省人民医院 ? 西京医院 ? 长安医院等
精准 分子 检测
转移
播散肿瘤细胞 （DTC）微转移休 眠灶
CTCS
取样简单、创伤小
基因检测准确性高 可评估肿瘤的侵袭 性
放 化 疗 患 者
手
术 患 者
无
法
门
穿
诊
刺
患
患
者
者
Genosaber Biotech Co. Ltd.
4
技术路线：
灵敏度最高的检测技术 600万个VS1个
肺癌 卵巢癌 结直肠癌
核心技术
循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离 出来并进入外周血液循环的肿瘤细 胞。
原发肿瘤血管生成 侵润
上皮－间质转化 （EMT）
侵润
转移
侵入血管内
循环肿瘤细胞 （CTC）
循环肿瘤 微栓 （CTM）
凋亡的CTC
肿瘤细胞 扩增 血管生成
间质－上皮转化 （MET）
侵入血管外 (CTC)
转移到骨髓 和其他器官
血管内增殖 (CTM)
中心
认证的标准的
基因扩增实验
室
临床基因扩增
检验实验室技
术人员上岗证
ABI 7500 PCR 仪
国家医疗器械 注册证
CTC
基因测序 表达谱检测 基因突变检测
特异性 灵敏度 自动化 血样体积
适应症
早期（I期） 敏感性
中晚期敏感 性
报告时间
可视化
Cytoplo Rare ?
（格诺）
免疫磁珠负向富集 靶向配体 PCR 技术
半自动
早、中和晚期肺癌
89% 6h/12 样本
否
CellSearch?
Cyttel TM （北京莱尔）
Canpatrol TM （益善）
流式正向富集技术荧 免疫磁珠负向富集、
光标记
Fish 技术
ISET （滤膜） 原位杂交 RNA 分析
80%
83%
75%
30%
腺癌： 46%
全自动
半自动
7.5mL
4mL
晚期乳腺癌、结直肠癌、 晚期肺癌、胰腺癌、乳
前列腺癌
腺癌
30% 半自动 5mL
晚期癌肿
0%
20%(2/10)
未报道
CTC-Biopsy ? （武汉友之友)
ISET （滤膜 ) 荧光标记
70% 30% 全自动 10mL
晚期癌肿
未报道
25% （22/87)
61%-88%
30%
40%
6h/8 样本
48h/1 样本
48h/1 样本
FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCCAg对NSCLC和早期NSCLC患者的诊断效率
检测方法
特异度（%）
约登指数 I期NSCLC 灵敏度（%）
AUC （95%CI ）
CTC
84.1
0.573
67.2
0.823 (0.773-0.874)
NSE CEA CA125 Cyfra21-1 SCC-Ag
95.9
0.055
94.9
0.25
97.6
0.175
90
0.352
93.8
0.15
4.6
0.585 (0.495-0.675)
18.5
0.76 (0.69-0.83)