HPLC_ELD法联用测纯度
elsd—hplc法
elsd—hplc法
ELSD-HPLC法是一种色谱分析方法，结合了ELSD（Evaporative Light Scattering Detection，蒸发光散射检测）和HPLC（High-Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱）技术。
这种方法常用于分析那些在紫外可见光谱中不易检测的化合物，如非挥发性、不具有紫外吸收或荧光发射性质的物质。
具体而言，ELSD是一种基于光散射原理的检测技术。
当非挥发性化合物在ELSD检测器中被蒸发并产生微小的颗粒时，这些颗粒会散射光线，ELSD检测器测量这些散射光的强度，进而得到对物质浓度的信息。
ELSD对于化合物的检测不依赖于其在紫外或可见光谱范围的吸收特性，因此适用于更广泛的化合物类型。
将ELSD与HPLC结合，就形成了ELSD-HPLC法。
HPLC用于分离混合物中的不同成分，而ELSD用于检测和定量那些在紫外光谱中难以检测的成分。
ELSD-HPLC法在药物分析、食品分析、天然产物分析等领域得到广泛应用，特别是对于一些低极性、不带有紫外或荧光响应基团的化合物的分析。
HPLC-ELSD法测定注射用阿奇霉素含量及有关物质
阿奇霉素一种半合成的十五元环大环内酯类的抗生素， 呈白色粉末或者晶体，具有吸收效果好，生物利用高、副作 用低、抗菌范围广等效果。在食入时无异味，偏苦，有轻微 的引湿性。在临床上主要用于治疗呼吸道、支气管炎、皮肤 软组织感染以及尿道炎等等。根据相关资料显示：注射阿奇 霉素可以有效抑制细菌的转肽，抑制蛋白质的合成，抗菌效 果好。不同的药物搭配阿奇霉素有不同的治疗效果，若使 用药物超标导致出现不良反应应及时根据患者的病情采取有 效的治疗措施。根据有关注射用阿奇霉素用量分析等相关知 识，按照《国家药品标准》测定其含量等，影响因素较多、
⑵专属性实验 在准确的精密度下选取适量的阿奇霉素对照品，将样品
分为4份。取1份样品加入，5ml稀释液溶解，加入lmol/L的 盐酸，在室内放60min后加入lmol/L的氢氧化钠混合稀释、摇 匀后稀释到25ml,作为酸降解产物；5ml稀释液溶解，加入 lmol/L氢氧化钠，在水浴内放置20min后，取出冷却。后加 入lmol/L的盐酸，稀释到25ml后作为碱降解产物；5ml稀释液 溶解，加入30%的过氧化氢，在室内放60min加入稀释液稀释 到25ml后作为氧化降解产物；在1309的高温破坏60min。液 稀释到25ml后作为高温破坏降解产物。根据实验结果表明：
品储备液中的5ml,将以上放置在与20ml的容器内，使用加
上稀释液溶解、稀释、摇匀均匀即可図。
② 在准确精密度下选取适量的阿奇霉素，放于100ml的
容器内，采用超声进行溶解，选取适当数量稀释液，后使用
HPLC-ELSD法同时测定益肺清化颗粒中的黄芪甲苷、桔梗皂苷D和麦冬皂苷D的含量
HPLC-ELSD同时测定丹参注射液中4种糖类成分的含量
HPLC-ELSD同时测定丹参注射液中4种糖类成分的含量黄利;葛婷;夏蕴琼;杨锦强;郑云枫;朱立静;刘将【摘要】目的:建立丹参注射液中果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖4种糖类成分的HPLC-ELSD分析测定方法.方法:采用Prevail Carbohydrate ES(250 mm ×4.6 mm,5μm)色谱柱,乙腈-水(67:33)为流动相,体积流量为1.0 mL· min-1；ELSD漂移管温度90℃,载气为空气,载气流量为3.0 L·min-1；柱温为35℃.结果:果糖、葡萄糖、甘露三糖和水苏糖的线性范围分别为375.6 ～ 187 8,233.0～1165,228.4～114 2,300.2～1 501μg·mL-1,平均回收率分别为102.4％,103.9％,103.1％,100.9％,RSD分别为2.18％,3.45％,2.56％,2.71％.结论:该方法具有准确、重现性好、简便等优点,可用于丹参注射液的质量控制.【期刊名称】《中国现代中药》【年(卷),期】2013(015)006【总页数】3页(P500-502)【关键词】HPLC-ELSD;丹参注射液;糖类【作者】黄利;葛婷;夏蕴琼;杨锦强;郑云枫;朱立静;刘将【作者单位】南京中医药大学药学院,江苏南京210029;南京中医药大学药学院,江苏南京210029;上海华源安徽锦辉制药有限公司,安徽阜阳236018;南京中医药大学药学院,江苏南京210029;南京中医药大学药学院,江苏南京210029;南京中医药大学药学院,江苏南京210029;上海华源安徽锦辉制药有限公司,安徽阜阳236018【正文语种】中文丹参注射液是临床常用于治疗冠心病、心绞痛的中药注射剂之一，具有活血化瘀、理气开窍之功效[1]。
已有研究表明，丹参注射液中除了含有酚酸类活性成分外，还含有含量较高的单糖及低聚糖类成分[2-5]。
HPLC—ELSD法同时测定三七药渣中的4种皂苷含量
HPLC—ELSD法同时测定三七药渣中的4种皂苷含量目的用HPLC-ELSD测定三七药渣中的三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1、Rd的含量。
方法色谱柱为Zorbax Extend C18（250mm×4.6mm，5um），流动相为乙腈-水梯度洗脱，柱温35℃，流速为1ml.min-1，ELSD漂移管温度为80℃，雾化气体压力为40psi，喷雾器温度30℃。
结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1、Rd分别在0.2052～4.104ug、0.2052～4.104ug、0.2228～4.456ug、0.2152～4.304ug呈良好线性关系；药渣中4种皂苷的平均回收率分别为97.02%，98.26%，97.09%，96.35%；该方法简便、准确，分离效果好，可用于三七药材的质量评价以及三七药渣有效成分的资源化利用。
标签：三七药渣；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；人参皂苷Rd；HPLC-ELSD法三七（Panax notoginseng（Burk） F. H. Chen）为五加科（Araliaceae）人参属植物，味甘、微苦，性温，归肝、心、胃、小肠经，具有止血、止痛、散瘀、消肿、补虚、强壮等功效，皂苷类成分是三七主要的生理活性成分[1]。
其中以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd含量较高，常作为其质量控制指标，笔者在本实验中采用HPLC-ELSD法检测并建立了三七药渣中4种皂苷类成分的测定方法，并对8个批次三七药渣4种皂苷类成分进行含量分析，为三七药渣资源化利用提供了可靠的依据。
1仪器与试药1.1仪器Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters2998 二极管阵列检测器，Waters 2424 蒸发光散射检测器，Empower2色谱工作站；电子天平；HH-4型恒温水浴锅；EPED 超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）。
1.2 试药R1，Rg1，Rb1，Rd对照品（纯度﹥98%，均购自南京泽朗医药科技有限公司），三七药材及药渣均来自山东某药厂，乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。
hplc - elsd 法
hplc - elsd 法
HPLC-ELSD是液相色谱-蒸发光散射的简称，是一种用于分析无法通过紫外检测器进行测定的半挥发性及非挥发性化合物的技术。
它采用全新的1290 Infinity II ELSD特殊光电倍增管以及激光器件，使其在灵敏度提高的同时，动态范围提高90倍，而且其独特的高精度玻璃喷头设计为峰面积重现性提供了保证。
该技术尤其适用于缺乏紫外吸收基团且不易挥发的药用辅料的分析。
最近安捷伦应用科学家在以往分析方法的基础之上，开发出基于HPLC-ELSD对生物制剂中吐温80和泊洛沙姆188同时进行定量分析的方法。
该方法具有分离度好、灵敏度高等优点，两种物质的定量限LOQ低至10ppm，且具有良好的线性关系、精密度和准确度。
HPLC-ELSD联用技术在药物分析、生物制药等领域具有广泛的应用前景。
HPLC-ELSD法同时测定烟肼丁醇片中盐酸乙胺丁醇和异烟肼的含量
烟肼丁醇片主药成分为盐酸 乙胺丁醇 、 烟肼 ， 异 收载于 国 家药品标准化学药 品地 方标 准 上升 国家 标 准第 二册 。盐 酸乙胺 丁醇为抗结 核药 ， 具有抑制结 核杆菌蛋 白与核酸合成 的作用。异烟肼对结核杆菌有抑制和杀灭作用 。标准 中盐酸
图 ２ 对 照 品 溶 液 色 谱 图
图 ３ 供试品溶液色谱 图
６ ７４ ９ ６ ６ ５０ ９ ２ ６６８ ５ ３ ７４６ ９ １ ７ ３ ． 、７ ６ ． 、９ ９ ． 、４ ２ ． 。计算含量 ， 盐酸 乙胺 丁醇和异 烟 肼 的平 均 含量 分别 为 ９ ．３ 和 ９ ． ２ ， ９ ０％ ８ ６％ Ｒ Ｄ分别为 １７ ％和 １８ ％ ， 果表 明方法重复性 良好 。 Ｓ ．５ ．５ 结 ２ ６ 稳定性 试 验 ． 取 样 品测 定 项 下 的供 试 品溶 液 （ 号 ： 批 ２ １０ １ ） ２ ４ ６ １ ０ ０９ ６ 在 ， ， ，２ｈ分 别进 样测 试 ， 录色 谱 图 （ 图 记 见 ３ ， ） 盐酸 乙胺 丁醇的峰面积分别是 ２９ ０ １０ ８ ３０ ７５ ７ ２ ０ ６ ． 、 ２ ０ ． 、 ３０７０ ７ ３ ２７ ４９ ３ ４ 异 烟肼 的峰面积分别是 ８０５ ８ ６ １ ２ ． 、 ２ ２ ． ； ０ ３ ． 、 ８ ４２ ６ ９ ８ ７６ ２ ３ ８ ９８ ７ ２ ９ ０ ． 、２ ３ ． 、４ ０ ． 。结果 盐酸 乙胺 丁醇片 峰面 积的 Ｒ Ｄ为 １９ ％ ， Ｓ ．６ 异烟肼 峰面积的 Ｒ Ｄ为 １６ ％ ， 明本 Ｓ ．８ 表
HPLC—ELSD法测定不同储存时间党参药材中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量
HPLC—ELSD法测定不同储存时间党参药材中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量目的建立党参药材中果糖、葡萄糖和蔗糖高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）含量测定的方法，并测定不同储存时间的党参果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。
方法采用80%甲醇超声提取，通过HPLC-ELSD法测定不同储存时间的党参中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。
色谱条件：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（250 mm ×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-水（77∶23）为流动相，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，ELSD检测器。
结果通过实验，不同储存时间的党参中果糖、葡萄糖和蔗糖均能很好分离，线性范围和相关系数分别为2.409～24.09 μg（r = 0.9999）、1.456～14.56 μg（r = 0.9995）、1.15～11.50 μg（r = 0.9999），平均回收率分别为103.73%（RSD = 0.26%）、97.85%（RSD = 1.98%）、99.08%（RSD = 1.09%）。
结论表明该方法简便，稳定性、重复性、分离度好，可用于党参中果糖、葡萄糖和蔗糖含量分析，储存0、3、6、12个月的不同时间党参中果糖、葡萄糖和蔗糖含量差异明显。
[Abstract] Objective To establish a HPLC-ELSD determination method of fructose，glucose and sucrose in Codonopsis pilosula，and to determine the content of fructose，glucose and sucrose of Codonopsis pilosula in different storage times. Methods The sample solutions made by ultrasonic extraction of 80% methanol solution were used to determine the contents of fructose，glucose and sucrose of Codonopsis pilosula in different storage times by HPLC-ELSD. The analysis was performed on a Shodex Asahipak NH2P-50 4E column （250 mm × 4.6 mm，5 μm）with a gradient elution of acetonitrile-water （77∶23）at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 25℃. It was determined by ELSD detector. Results The methodological studies showed that fructose，glucose and sucrose of Codonopsis pilosula in different storage times were in good linearity from 2.409 to 24.09 μg （r = 0.9999），1.456 to 14.56 μg（r = 0.9995），1.15 to 11.50 μg （r = 0.9999）respectively. The average recoveries of the three components were 103.73% （RSD = 0.26%），97.85% （RSD = 1.98%）and 99.08% （RSD = 1.09%），respectively. Conclusion The results show that the method is convenient，stable，reproducible and well separated. It can be used to determine fructose，glucose and sucrose in Codonopsis pilosula. The content of fructose，glucose and sucrose in Codonopsis pilosula of different storage times（0，3，6，12 months）are different obviously.[Key words] Codonopsis Radix；Fructose；Glucose；Sucrose；HPLC-ELSD；Assay黨参来源于桔梗科植物党参Codonopsis Pilosula （Franch.）Nannf.、素花党参Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta（Nannf.）L. T. Shen 或川党参Codonopsis tangshen Oliv. 的干燥根[1]。
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高效液相色谱分离-蒸发光散射检测法测定海藻糖的纯度魏 泱,丁明玉*(清华大学化学系,北京100084)摘 要:用反相高效液相色谱法分离-蒸发光散射检测法测定了海藻糖的纯度,检测下限为5mg /L 。
在30～1000m g /L 范围内,海藻糖浓度的对数与ELSD 测得的峰面积对数具有良好的线性关系。
关键词:高效液相色谱法;蒸发光散射检测法;海藻糖中图分类号:O 657.7 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2001)01-0005-03 海藻糖(trehalo se )是一种二糖,由两个葡萄糖分子通过T -T-(1→1)糖苷键链接而成。
它是一种非还原性糖,在酵母中含量很高。
可以在干燥的环境中起到保护酶、疫苗等活性物质的作用,目前在化妆品、医药等方面得到了愈来愈广泛的应用。
中国科学院微生物研究所利用生物合成,从酵母中提取出高纯度的海藻糖。
传统定性分析海藻糖的方法主要是纸层析和薄层层析法。
纸层析法也可作为定量分析海藻糖的方法,但其定量的准确度和重现性都无法与高效液相色谱法(HPLC)相比。
HPLC 法通常用糖分析柱[1]、氨基键合柱[2～4]或C18柱[5,6]作固定相,以乙腈和水的混合溶剂或纯水为流动相来分析糖。
糖本身在紫外区无吸收,通常使用示差折光检测器(RID)[1,6],或者通过衍生化[2,5]后再进行检测。
RID灵敏度较低,衍生化法操作繁琐,且不可避免地会引入误差。
蒸发光散射检测器(ELSD )作为一种新型的通用型检测器,目前正得到越来越广泛的应用。
ELSD 利用了流动相与被测物之间的蒸汽压相对差异,柱洗脱液进入雾化器针管,在针的末端,洗脱液和充入的气体(通常为氮气)混合形成均匀的微小液滴;漂移管的作用在于使流动相挥发,蒸汽压较小的被测物颗粒经过漂移管进入光散射池;在光散射池中,被测物颗粒散射光源发出的光,经检测器检测散射光,产生电信号。
ELSD 在检测类酯[7]、表面活性剂[8]等物质中发挥着较大的作用,同样可以直接对糖[3,4]进行检测,且具有较高的灵敏度。
本研究力图通过实验,建立起一种快速、准确、直接测定海藻糖纯度的HPLC /ELSD 法。
1 实验与方法1.1 仪器与试剂HP1100高效液相色谱仪(美国Hew lett Packard 公司):配有四元梯度泵、二极管阵列检测器(DAD )和化学工作站。
另配有Alltech 500ELSD (美国Alltech 公司)。
海藻糖,纯度98.5%(Sigm a 公司);海藻糖样品(中国科学院微生物研究所合成);甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯。
水为二次重蒸去离子水。
流动相使用前用0.45μm 滤膜过滤。
1.2 色谱条件色谱柱:Zo rbax SB-C18(4.6mm ID ×25cm ,5μm ),Hew lett Packard 公司产品,流动相:甲醇—水(4∶1,V /V ),流速:0.8m L /min;柱温:25℃;进样量:20μL;ELSD 参数:漂移管温度为75℃,氮气流速为 1.75L /min 。
1.3 标准溶液的配制称取101.5mg 海藻糖标样(98.5%)溶于100m L 甲醇中配制成储备液(对应海藻糖浓度为1000mg /L )。
使用前以甲醇稀释成适当浓度的工作溶液。
收稿日期:2000-03-02;修订日期:2000-05-19作者简介:魏 泱(1975-),男,硕士研究生—5—第20卷第1期2001年1月 分析试验室Chinese Jour na l o f Analysis Labo rato ry V ol.20.No.12001-1DOI:10.13595/ k i .i ssn 1000-0720.2001.00022 结果与讨论2.1 分离条件的选择由于海藻糖样品系生物合成,纯度很高。
在实验中,不断改变流动相中甲醇和水的比例,主要目的在于使海藻糖在合适的时间内被洗脱。
当甲醇-水的比例为4∶1时,海藻糖在3min 左右出峰。
见图1。
图1 ELSD 检测海藻糖标样(a )和样品(b )的色谱图Fig .1 C hromatograms of standard (a )and sample (b )detected by ELSD2.2 ELSD 条件优化根据流动相的种类和比例,首先设漂移管温度为70℃,氮气气速为 2.0L /min 。
保持气速不变,改变漂移管温度,观察信号基线水平和噪音,75℃时流动相基本挥发,噪音不是太大。
固定漂移管温度为75℃,观察不同氮气流速时海藻糖的信号强度,1.75L /min 为在较小噪音水平上,产生最大检测响应值的最低气速。
故选定漂移管温度为75℃,氮气气速为 1.75L /min 。
2.3 线性关系考察将海藻糖贮备液稀释配成30,50,100,300,500mg /L 的系列浓度,依次进样20μL,根据ELSD 测得的峰面积对相应的标准溶液浓度进行线性回归,发现线性很差。
以海藻糖浓度的对数对ELSD 测得的峰面积的对数进行线性回归,两者间存在着良好的线性关系,结果见表1与图2。
将最小浓度的标准溶液再逐级稀释,依次进样20μL,计算当信噪比为3时对应的标准溶液浓度以确定检出下限,得到的海藻糖检测下限为5mg /L 。
2.4 海藻糖样品的测定对同一份样品,重复进样5次,用ELSD 测定其峰面积,取5次测定平均值计算样品中海藻糖含表1 EL SD 检测海藻糖线性关系考察Tab .1 Investigat ion on linear relation between concentra -tion of trehalose and peak area detected by ELSD海藻糖浓度(×10-4%)峰面积浓度的对数值峰面积的对数值306116.0 1.477 3.7865013854.6 1.699 4.14210042876.0 2.000 4.632300194692.6 2.477 5.289500353674.5 2.699 5.5491000864179.33.0005.937图2 海藻糖浓度的对数与峰面积的对数线性关系图Fig .2 Linear relation between logarithm of concentrationand logarithm of pea k area—6—量。
在样品溶液中加入已知量的海藻糖标准溶液,测定其回收率,结果见表2。
表2 海藻糖纯度的测定结果Tab.2 Purity determination results of trehalose by ELSD 纯度(%)回收率(%)R SD(%)99.2199.420.932.5 讨论使用反相高效液相色谱法分离糖时,可以采用纯水做流动相。
利用ELSD的操作使全部柱流出物都进入直的漂移管,让流动相在其中蒸发,为了有利于蒸发必须使用较高的操作温度。
如果采用纯水做流动相,相应地,ELSD就必须采用较高的漂移管温度和较大的雾化器载气气速,使得ELSD检测的峰面积减小,降低了灵敏度。
故本文采用沸点较低的甲醇为主作为流动相。
在使用当前的色谱条件时,当海藻糖浓度为30～1000mg/L范围内,其浓度与ELSD测得的峰面积线性关系很差,而将它们取对数后再进行拟合,则可得到良好的线性关系。
采用同一台ELSD 在正相条件下,检测天麻甙(对羟甲基苯U-D-吡喃葡萄糖甙),天麻甙浓度在21.3～890mg/L范围内,其浓度与ELSD测得的峰面积线性关系很好,将它们取对数后再进行拟合,其线性关系不如前者(详情另报)。
可见ELSD的响应值与被测物浓度的关系曲线比较复杂,这与许多文献的报道是一致的,其具体关系尚处于研究中。
RID是检测糖主要的检测器之一,但它对工作环境要求很苛刻,要求恒温,恒流速,且无法采用梯度洗脱,其检测灵敏度也不够高。
ELSD的出现,在一定程度上弥补了HPLC传统检测器的不足,特别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测,显示出其优越性。
采用高效液相色谱蒸发光散射检测验正海藻糖的纯度,方法可靠,灵敏度较高。
ELSD检测过程中,无溶剂峰干扰,基线平稳。
参考文献[1] 高文元,肖培根.中国中医杂志.1997,22(10):590[2] Steve n R H,Sa lv ato re J T.A nal Biochem.1985,146:143[3] M ac rae R,Dick J.J Ch ro ma tog r,1981,210:138[4] Clement A,Yong D,Br echet C.J Liq Chr oma to g r,1992,15(5):805[5] 丁明玉,小泉均,铃木义仁.色谱.1997,15(4):281[6] 甘宾宾.色谱.1999,17(1):87[7] M a rcato B,Cecchin G.J Chr omato g r A,1996,730:83[8] Kibbey T C G,Yav araski T P,Hay es K F.J Chr o-mato g r A,1996,752:155Purity Examination of Trehalose by HPLC with ELSD W EI Yang and DI N G Ming-yu(De-pa rtm ent o f Chemistry,Tsinghua Univ ersity, Beijing100084),Fenxi Shiyanshi,2001,20(1):5～7Abstract:A rev ersed-phase high performance ch romatog ra phy with evaporativ e light-scattering detecto r(ELSD)using m ethano l-wa ter(4∶1, v/v)as m obile phase was established fo r direct purity exa mination o f trehalo se.An ODS colum n Zo rbax C18w as em ploy ed.Reg ressio n equations rev eal linea r relationship betw een log arithm of trehalo se concentra tion and lo garithm of trehalose peak area detected by ELSD in th e range of30～1000mg/L trehalose.Recoveriy o f trehalose m ea-sured by ELSD is99.42%w ith detection limit of 5mg/L.Keywords:H ig h perfo rmance liquid chrom atog ra-phy;Ev apo ra tiv e light-scattering detector;Purity examination;Trehalose—7—。