108、临床PCR实验室常见问题及整改措施
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR核酸检测实验室自检自查整改报告
PCR核酸检测实验室自检自查整改报告一、整改背景我实验室负责进行PCR核酸检测工作，经过自检自查发现存在一些问题，不仅影响了工作效率，还可能对检测结果产生误差，为了保证检测结果的准确性和可靠性，我决定开展整改工作，并报告整改情况。
二、问题分析1.设备运行不稳定：实验室PCR仪器出现频繁故障，导致实验进度受阻，影响工作效率。
2.试剂保存不当：一部分试剂未按照要求储存，导致试剂失效或效果下降，影响了检测结果。
3.数据记录不完整：实验过程和结果记录不规范，缺乏关键信息的记录，影响了结果的追溯和分析。
4.实验室清洁和消毒不及时：仪器和试剂的清洁消毒不及时，可能造成交叉污染，影响结果的准确性。
三、整改措施1.设备运行不稳定问题的整改：（1）定期检查设备状态，及时发现问题并解决；（2）建立设备维护保养制度，确保设备运行稳定；（3）配备备用设备，确保实验进展不受阻。
2.试剂保存不当问题的整改：（1）制定试剂存储和使用规范，明确存储温度、有效期等要求；（2）建立试剂使用登记制度，及时更新试剂信息，避免使用失效试剂；（3）实行试剂定期盘点，清理不合格和失效试剂。
3.数据记录不完整问题的整改：（1）建立标准的实验记录表格，详细记录实验过程和结果；（2）明确记录项目、时间、操作人员等关键信息；（3）实行项目负责人审核制度，确保记录的准确性和可追溯性。
4.实验室清洁和消毒问题的整改：（1）制定实验室清洁消毒制度，明确清洁和消毒频率；（2）定期进行实验室清洁和消毒，清除交叉污染源；（3）培训实验人员正确进行仪器和试剂的清洁消毒。
四、整改效果评估经过整改措施的落实，以下是整改效果的评估：1.设备运行不稳定问题：设备故障率显著下降，实验工作进展顺利，工作效率明显提升。
2.试剂保存不当问题：试剂使用失效或下降的情况明显减少，检测结果更加可靠稳定。
3.数据记录不完整问题：实验记录规范化，关键信息完整记录，结果可追溯性明显增强。
4.实验室清洁和消毒问题：实验室清洁和消毒规范化，交叉污染风险得到控制。
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案
PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。
但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1、模板:含有抑制物，含量低2、Buffer对样品不合适3、引物设计不当或者发生降解4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2、更换Buffer或调整浓度3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4、降低退火温度、延长延伸时间问题二：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物或者使用巢式PCR2、适当降低模板或引物浓度3、适当减少酶量4、降低镁离子浓度5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6、减少循环次数问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1、模板不纯2、Buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg 2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换Buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP和镁离子的浓度6、减少循环次数问题四：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存[ 来源]：实验室之家，以及相关网络知识、转载仅为分享知识，如有侵权请联系删除。
}热文推荐：1、化学分析方法确认和验证指南PDF版全文（新版2018年4月1日实施）2、最全微生物实验室规划设计方案3、谱知识总结篇4、移液器操作六部曲，这些细节很重要化学先生（号码：chemistrysir），化学检测工作者自己的公众号。
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法检验科人员是核酸检测工作的主力军，我们不但要保证检测结果的有效性，还时刻面临着被感染的风险。
本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。
1、传染源目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。
无症状感染者也可能成为传染源。
2、传播途径经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径。
在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。
由于在粪便及尿中可分离到新型冠状病毒，应注意粪便及尿对环境污染造成气溶胶或接触传播。
3、荧光PCR原理重复进行“变性 - 退火 - 延伸”三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。
4、常见问题解析①新冠试剂出现翘尾，怎么处理？答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。
如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。
设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
③新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。
PCR检测常见问题与解决途径
P C R检测常见问题与解决途径------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxxPCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
PCR实验室存在问题及解决措施
8
临床应用基本规范和管理要求
➢ 以科研为目的的临床基因扩增检验项目，不得向临床出具检验报 告，不得向病人收取任何费用
9
检测要求
➢ 项目：新开展检测项目应有相应临床科室出具的评估报告 ➢ 仪器：必须三证齐全 ➢ 试剂：必须SFDA批准 ➢ 新开展项目在技术审核前应进行方法学验证 ➢ 仪器、试剂、方法更新时应进行方法学验证
1、校准SOP中制定仪器校
2、部分仪器未定期校准
准参数、判断标准
2、实验室检测人员提出校
3、校准未覆盖检测常用量程（移液器、恒温金属浴） 准要求
4、校准报告不规范，缺原始记录
3、实验室审核校准报告
5、校准报告中校准数据错误未发现 6、校准不符合要求的设备仍在使用（移液器、高速
冷冻离心机） 7、未引用校准出现的校准因子（、温度计、恒温金
属浴） 8、内部校准存在问题：用于校准恒温金属浴的温度
计未校准；且最小刻度为1℃，不适用于金属浴 校准；内部比对（温度计）无记录或记录信息不
4、内部比对记录信息最少 应包括：比对设备编号、 用于比对设备的校准信息 （校准日期、校准有效期、 校准单位）、比对时间、 标准设备实测数据、比对 设备实测数据、判断标准、 结论、比对人、比对日期、 科室负责人
究和使用情况的检索报告及技术资料
14
PCR审核
流程（初审、
复审、扩项、 新技术）
医疗机构提出技术审核申请 申请资料审查
受理、登记、编号 发出《技术审核受理通知书》
文件内容审查 确定审核专家组成员 书面通知专家、医疗机构 组织专家现场审核 汇总专家组审核意见 医疗机构就专家意见整改 完成技术审核结论报告
临床PCR检测中常见问题及分析
设置不当导致的假 阳性曲线
设置不当导致的假 阴性曲线
不正常扩增曲线的分析探讨 • 阈值设置 析改动 常见经常设定为自动,个别时候需要人为分
设置不当导致的假 阳性曲线 设置不当导致的假 阴性曲线
科华核酸诊断试剂产品
核酸种类 试剂盒产品名称
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 （PCR-荧光探针法） 沙眼衣原体核酸检测试剂盒 （PCR-荧光探针法）
• 标本处理：柱抽提方法提取标本中病原体 RNA 加入裂解液释放核酸——介质吸附核酸——过滤洗涤——核酸洗脱
•
二氧化硅吸附核酸，以负压纯化柱方式实现核酸纯化，以半自动操作代替手工操作，极 大地降低了实验操作的技巧要求，受人工操作影响显著减少，检测速度快、结果重复性 好
二氧化硅膜 吸附核酸 手工：
离心法
核酸定量检测：通过工作 标准品生成的标准曲线， 获得待测标本的初始核酸 模板浓度
实时荧光定量PCR产物的检测和结果分析
Ct （Cp）值是实时荧光PCR的主要定量参 数和定性判断参数 不同核酸含量的样本检测得到的Ct（Cp） 值不同，Ct值越小表明模板浓度越高
仪器自带软件分析定量检测结果
不正常扩增曲线的分析探讨 • 基线设置 分析改动 常见设定为3-10 循环,个别时候需要人为
注册号
国食药监械(准)字2008第 3400932号 国食药监械(准)字2009第 3400912号 国食药监械(准)字2009第 3400914号 国食药监械(准)字2009第 3400913号 国食药监械(准)字2011第 3400113号 国食药监械(准)字2009第 3400677号 国食药监械(准)字2010第 3400117号 国食药监械(准)字2012第 3400079号
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概况
上海市临床检验中心制定了 《上海市医疗机构临床实验室质量管理基本内容和要求》（附录E） 《上海市医院临床检验专业质控督察表（分子生物学专业）》
2011年起每年年底根据上述要求进行上海地区PCR实验室全覆盖督查
实验室设置
督察内容
检查方法
按照《医疗机构临 床基因扩增检验实 验室管理办法》和 《基因芯片诊断技 术管理规范（试 行）》相关要求执 行
（五）卫生部规定的其他需要特殊管理的医疗技术
概况
《上海市卫生局<关于指定上海市临床检验中心作为本市医疗技术临床 应用能力技术审核机构的通知>》（沪卫医政[2011]090号） 《上海市临床检验中心关于印发<上海市医疗机构临床基因扩增检验技 术审核办法>和<上海市医疗机构基因芯片诊断技术审核办法>的通知>》 （沪临检办[2011]29号） 2014年中心自行开发了分子诊断技术临床应用管理专栏，其中包括审 核申请、审核查询、公共查询、政策法规等栏目。（） 《国务院关于第一批取消62项中央指定地方实施行政审批事项的决定》 （国发〔2015〕57号） 截止至2015年11月，目前通过审核的实验室有104家。
医疗技术临床应用管理办法
（分类分级管理、审核）
第一类：安全性、有效性确切，医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其 安全性、有效性的技术—医疗机构自行组织实施
第二类：安全性、有效性确切，涉及一定伦理问题或者风险较高，卫生行政部
门应当加以控制管理的医疗技术—省级卫生行政部门指定或者组建的技术机
构负责技术审核
照等方式电子版保留)
人员资质
督察内容
检查方法
存在问题
整改措施
实验室至少应有2 名具有临床基因扩 增检验技术上岗证 的本单位在职技术 人员。开展遗传性 疾病或基于组织、 细胞等分子病理并 出具诊断报告的实 验室，至少应有1 名具备出具相关诊 断报告资质的本单 位在职医师。
检查检测人员的相 关资质、PCR上岗 证等。
临床基因扩增检验技术；
第三类：具有下列情形之一，需要卫生行政部门加以严格控制管理的医疗技术—卫生
部或卫生部委托省级卫生行政组织负责对指定的第三类医疗技术进行审核
（一）涉及重大伦理问题
（二）高风险
（三）安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进一步验证
基因芯片诊断技术
（四）需要使用稀缺资源
（2011.5.3调整为二类）
临床PCR实验室常见问题及整改措施
回顾
1990年：PCR 技术在国内开始用于临床检测 90年代中期：假阳性？（假阴性？） 《关于暂停临床基因扩增检验的通知》（卫医政发[1998]第9号） 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号） 《医疗技术临床应用管理办法》的通知（卫医政〔2009〕18号） 《临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号）
床基因扩增检验
技术上岗证书复
印件；培训、能
力评审等资料，
并定期更新。
督察内容
人员培训与评估
检查方法 存在问题
整改措施
临床实验室负责人 应组织实验室人员 进行业务学习和培 训，有相应的学习 培训制度、计划和 记录，并定期（每 12个月至少一次） 对学习培训效果进 行评估。
检查PCR相关 人员培训记 录，培训效 果进行评估 的记录。
人员管理
督察内容
检查方法
存在问题
整改措施
应建立全部人员 PCR人员档案记 相关的教育背景、录 专业资格、培训、 经历及能力记录 档案。
1.实验室技术人员 实验室应分册建
档案内容过于简单： 立技术人员技术
只有学历、职称、 档案，档案至少
PCR上岗证书复印件，应包括以下内容：
其余缺
学历、职称、临
2.未及时更新
1.未取得上岗证的 人员独立操作，主 观认为只要不在报 告上出现名字就可 以；
2.病人报告单上的 检测人员和审核人 员与实际不一致；
3.试剂公司人员参 与检测。
1.及时参加培训取 得上岗证；
2.规定报告审核操 作规程。
人员资质
督察内容
新进人员应有 岗前培训
检查方法 存在问题
整改措施
检查新进人 员培训记录
实验室应有适合自身实际情况又 符合现行规章制度的记录管理制 度及记录表格
记录不全\潦草\ 记录应完整，修改应采用杠改；
涂改\不真实
记录应真实可追溯
仪器坏，数据丢 原始数据应定期备份（不同电脑） 失
无仪器打印结果 无仪器打印结果的检验项目记录 的检验项目缺原 信息至少应包括检测项目、试剂 始记录或记录不 品牌、批号、有效期、标本唯一 全（例杂交项目 编号、检测结果、检测者、检测 记录保存有缺陷） 日期（例杂交建议采用扫描、拍
根据使用技术的要求 相应增加区域
试剂分装应在试剂准 备区操作 II区安装冲眼器并保 证正常使用状态
每个实验区配备移动 紫外车并保证正常使 用状态
文件和记录管理
督察内容
检查方法
原始记录和质 检查原始记 量记录应完整、 录和质量记 清晰，至少保 录。 存2年。
存在问题
整改措施
记录表格设计不 适用（或简单或 复杂）
1.缺相应的制度
2.以为取得PCR上岗 证就可以
3.初审实验室大多数 缺员工是否能胜任其 岗位的记录
1.实验室应制定员工能力评 审的内容和方法（新进、转 岗）。
2.定期评审员工的工作能力， 并保存胜任的证据：直接观 察常规工作过程和程序、直 接观察设备维护和功能检查、 监控检验结果的记录和报告 过程、核查工作记录、评估 解决问题的技能、检验特定 样品。
实验室分区 设置应符合 检测方法要 求
存在问题
各缓冲间相通，实际使用 和验收时不一致
未根据项目相应增加IV区 （例采用杂交法开展HPV 分型项目）
试剂准备区形同虚设（无 移液器等） 未安装冲眼器或不能正常 出水 移动紫外车缺或已坏未及 时更换
整改措施
1.实验时随手关门 2.缓冲间相同的实验 室应封锁通道
1.缺培训计划、或 记录
1.计划制定应有针对性， 每年有重点 2.培训形式可以多样：讲 座（包括小组教学）、计 算机相关的练习、自学、 观看示例- 现场或视频、 实践监督、实践结果的自 我评估、特殊样品的检验 或鉴定 3.效果评估形式：口头提 问、笔试、现场操作演示、 获取合格证、填写培训小 结等