高通量测序临床应用的标准化
高通量测序临床应用的标准化
高通量测序临床应用的标准化随着生物技术的快速发展，高通量测序技术在临床诊断和治疗中的应用越来越广泛。
高通量测序是指一种能够同时测定大量DNA或RNA序列的技术，其应用范围涵盖基因组学、转录组学、表观遗传学等多个领域。
然而，为了确保高通量测序在临床应用中的准确性和可靠性，标准化的实施显得尤为重要。
标准化的目的是为了确保高通量测序结果的一致性和可比性。
首先，需要明确测序实验的基本步骤和流程。
在实验之前，需要对样本进行质量评估，包括浓度测定、纯度检测和库构建评估等。
然后，选择合适的测序平台和引物，进行PCR扩增和文库构建。
接下来，进行高通量测序，获取原始测序数据。
最后，对原始数据进行质控和分析，得到可靠的测序结果。
其次，标准化还需要确保测序实验的操作规范。
包括实验室环境的控制、仪器设备的标定和维护、试剂的选择和使用等。
此外，还需要建立适当的质量管理体系，监控实验的质量控制指标，并进行数据记录和存档，确保实验过程的可追溯性和数据的可验证性。
在高通量测序临床应用中，标准化还涉及到数据分析的统一标准。
由于高通量测序产生的数据量巨大，数据处理和分析变得尤为关键。
因此，需要制定统一的数据处理流程和分析方法，确保结果的可靠性和可重复性。
此外，还需要建立适合临床应用的数据解读标准，将测序结果与临床信息相结合，为诊断和治疗提供准确的依据。
除了实验和数据分析的标准化外，高通量测序临床应用还需要建立完善的质量控制体系。
质量控制包括质控样品的选取和验证、实验过程中的质控指标的监控等。
质控样品的选取应覆盖不同类型的疾病和样本来源，确保测序实验在不同疾病和样本类型下的可靠性。
质控指标的监控可以通过合适的质控样品和质控数据进行，及时发现并纠正实验过程中的问题。
随着高通量测序临床应用的不断推广，相关的标准化指南和规范也在不断完善和更新。
例如，国际标准化组织（ISO）已经发布了高通量测序质量控制与质量保证的标准（ISO 20021）。
《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》要点
《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用
规范化专家共识》要点
1.术语标准化：为了避免混淆和误解，专家共识明确了一些术语的定义，包括“高通量宏基因组测序”、“病原微生物”、“DNA序列中的细菌”等。
这有助于各个实验室在交流和报告结果时使用一致的术语。
2.样本采集和存储：专家共识提供了关于病原微生物检测样本采集和
存储的指导，包括不同类型样本（如血液、尿液、呼吸道标本等）的采集
方法、存储条件和保存时限。
这有助于确保样本的质量和可靠性。
3.样本前处理：在进行高通量宏基因组测序之前，样本需要经过一系
列前处理步骤来减少污染和提取纯净的DNA。
专家共识对样本前处理方法
进行了评估，并提供了一些建议和技巧。
4.数据分析：高通量宏基因组测序技术产生大量的DNA序列数据，而
正确且准确的数据分析是关键。
专家共识探讨了不同的数据分析方法，包
括序列质量控制、去除宿主DNA序列、去除污染序列、序列比对和分类等。
此外，针对不同的病原微生物，还提供了相应的数据分析策略。
5.结果解释和报告：高通量宏基因组测序技术可以提供详细的病原微
生物信息，包括物种鉴定、抗药性基因检测等。
专家共识指导了如何正确
解读和报告这些结果，包括确定阈值、结果解释的限制、结果比对和报告
格式等。
6.质控和规范化：为了确保高通量宏基因组测序技术的可靠性和准确性，质控和规范化非常重要。
专家共识列出了一系列质控措施和规范要求，包括样本质量评估、实验室设施要求、实验人员培训等。
2020版：高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识(遗传病部分)
2020版：高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识（遗传病部分）遗传病是指由于基因突变或染色体数目或结构变异导致的疾病。
根据遗传物质的改变情况，可分为单基因病、多基因病、染色体病、线粒体遗传病和体细胞遗传病[1]。
目前，人类在线孟德尔遗传数据库（OMIM）已经收录了6 000多种分子基础已知的遗传病[2]。
因为遗传异质性和表型多样性，以往的检测方法例如Sanger测序和染色体芯片分析（CMA）等在成本、通量和诊断敏感性等方面难以满足临床应用需求。
近年来，高通量测序即下一代测序（NGS）技术因其可同时对多个基因，甚至全外显子组和全基因组进行测序，现已被广泛应用于遗传病诊断领域，极大地提高了遗传病诊断的预期[3]。
但与以往技术相比，基于NGS技术的检测操作步骤多，对人员能力要求高，不规范使用或过度使用都有可能给受检者及其家庭造成不可预期的困扰和伤害，为保障高通量测序技术在遗传病临床检测中的规范应用，在借鉴国内外相关指南、标准、规范和权威发表的文献，以及《高通量测序技术临床检测规范化应用北京专家共识（第一版通用部分）》[4] （以下简称"通用共识"）的基础上，北京市临床检验中心、北京医学会检验医学分会、首都医科大学临床检验诊断学系、北京市医学检验质量控制和改进中心牵头起草了《高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识（第一版遗传病部分）》。
本共识中的声明内容为专家讨论并推荐的要点。
遗传病高通量测序实验室建设的总体要求遗传病高通量测序实验室建设时，在实验室环境条件（通风、温湿度、洁净和防震等）、仪器设备配备及日常维护与定期校准和人员专业知识及能力要求等总体上应满足"通用共识"的要求[4]，实验室分区设计则在遵循"通用共识"中所阐述的"32字原则"上，同时要考虑遗传变异检测的特点。
实验室应根据不同的遗传检测项目、检测流程、测序平台、建库策略及工作量大小制订切实可行的分区方案。
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识引言高通量宏基因组测序技术是一种快速、灵敏、高通量的新一代测序技术，它能够同时检测多个样本中的病原微生物，并提供详细的遗传信息。
随着相关技术的不断创新和发展，高通量宏基因组测序技术已经在临床微生物学的研究和诊断中取得了显著的突破。
为了规范和促进该技术在临床应用中的使用，研究人员、临床医生和相关专家共同制定了本文档，旨在提供高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识。
背景病原微生物的检测对于诊断和治疗临床感染疾病非常重要。
传统的微生物学检测方法存在一定的局限性，如无法同时检测多个病原微生物，检测结果需要较长时间等。
而高通量宏基因组测序技术可以通过同时测定多个DNA或RNA样本中的微生物基因组序列，快速、准确地鉴定和定量病原微生物，并提供详细的遗传信息。
技术原理高通量宏基因组测序技术主要包括DNA或RNA的提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。
首先，从临床样本中提取DNA或RNA，并使用特定的引物扩增目标基因组或全基因组序列。
然后，将扩增的DNA或RNA文库构建成测序文库，经过高通量测序仪进行测序。
最后，通过数据分析得到鉴定和定量病原微生物的结果。
临床应用1. 临床诊断高通量宏基因组测序技术可以快速鉴定病原微生物，并提供详细的遗传信息，对于临床感染疾病的诊断非常有价值。
通过该技术，可以检测多种微生物，包括细菌、真菌和病毒等，为临床医生提供准确的诊断依据。
2. 菌群分析高通量宏基因组测序技术可以对人体菌群进行深入研究。
通过测序分析，可以了解人体内各种微生物的组成和数量，对于研究肠道菌群与人体健康之间的关系非常重要。
3. 药物耐药性检测高通量宏基因组测序技术可以用于检测病原微生物对药物的耐药性。
通过测序分析，可以对病原微生物的基因组进行全面检测，并鉴定其中的耐药基因。
这对于合理选择抗生素和制定个体化的治疗方案非常有意义。
4. 疫情监测高通量宏基因组测序技术在疫情监测中也发挥着重要作用。
高通量测序数据质控与规范化标准策略
高通量测序数据质控与规范化标准策略概述高通量测序技术的快速发展使得DNA和RNA测序的数据量大大增加，但也带来了数据质量的挑战。
为了确保测序数据的有效和可靠性，数据质控变得至关重要。
本文将介绍高通量测序数据质控的概念、方法以及规范化标准策略。
高通量测序数据质控的概念与目的高通量测序数据质控是指对测序产生的原始数据进行筛选、修剪和过滤的过程，以保证测序数据的质量、准确性和可靠性。
其主要目的是排除测序错误、降低测序噪音、消除仪器偏差，从而提高后续的数据分析的可靠性和准确性。
高通量测序数据质控的方法1. 原始数据质量评估：通过查看原始测序数据的质量评分，了解测序品质是否符合预期。
常用的质量评估工具包括FastQC和FASTX-Toolkit等。
这些工具可以提供质量评分、测序错误率、碱基分布图和GC含量等信息。
2. 质量修剪：根据原始数据的质量评估结果，进行质量修剪以去除序列末端存在较低质量的碱基和存在测序错误的片段。
常用的质量修剪工具包括Trimmomatic和Sickle等。
3. 过滤低质量片段：利用阈值设定，将低质量或低复杂度序列片段过滤掉。
这些片段通常是由测序错误或其他噪音引起的。
例如，利用工具如Prinseq和Cutadapt可以识别和过滤掉含有adapter序列或低复杂度序列的片段。
4. 排除污染序列：高通量测序数据中可能存在污染序列，如来源于实验室环境、试剂盒或菌群等。
通过比对到污染基因组和参考序列，可以鉴定和排除这些污染序列。
相关的工具包括Kraken和MetaPhlAn等。
5. 数据规范化：将测序数据转化为标准化的格式，使得不同实验数据可以进行合理的比较和集成分析。
数据规范化通常包括去除冗余信息、统一序列命名和格式、合并重复数据等步骤。
规范化标准策略为了确保测序数据质控的准确性和可比性，制定一套规范化标准策略是必要的。
以下是一些常见的规范化标准策略：1. 样品标识和元数据记录：为每个样品分配唯一的标识符，并记录与样品相关的元数据信息，如样品来源、实验设计和处理方法等。
高通量测序技术在临床医学中的应用
高通量测序技术在临床医学中的应用摘要：现行的高通量测序技术是第二代测序技术，与第一代技术相比在速度、精准度和成本方面有明显优势。
如今，高通量测序技术在医学领域的应用越来越广泛，对我国医学领域的发展也能起到促进作用。
基于此，本文重点对高通量测序技术进行阐述，结合高通量测序技术的原理分析了该技术在临床医学的应用路径，以期为相关领域提供更多的理论参考依据。
关键词：高通量测序技术；测序技术；临床医学引言新一代的测序技术实际上就是我们所说的高通量测序技术，在传统测序技术基础之上有明显提升，高通量测序技术能够实现同时测序上千万条DNA序列，从而实现对某个物种整体转录组和基因组的深入分析。
随着高通量测序技术的发展，该技术已经在医学领域得到广泛应用，尤其是在肿瘤、寄生虫病、遗传病等体现出了特有的效果。
所以，高通量测序技术也成为我国医学领域的重要技术。
一、高通量测序技术的概述（一）高通量测序技术介绍高通量测序技术，也称为“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology）或大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS），是一种能够一次并行对大量核酸分子进行序列测定的技术。
该技术运用了生物信息学、纳米孔测序和并行测序等多种技术，能够高效、快速、准确地测定大量核酸分子的序列。
与传统的Sanger双脱氧法测序相比，高通量测序技术具有更高的测序速度和更高的通量，一次测序反应就能产出不低于100Mb的测序数据。
高通量测序技术的应用范围非常广泛，包括基因组学、遗传学、分子生物学、临床医学和癌症研究等领域。
通过该技术，我们可以对特定基因组或全基因组进行深入研究，发现新的基因及其变异体，了解基因的表达调控机制，为疾病的治疗和预防提供依据。
虽然高通量测序技术已经取得了许多重要的成果和突破，但仍然存在一些挑战和限制，如数据分析和解读的难度、对实验条件和操作技能的要求、伦理和隐私问题等。
高通量测序临床应用的标准化
高通量测序临床应用的标准化国家卫生计生委临床检验中心李金明主任发表了《高通量测序临床应用的标准化》的主题演讲。
李主任开篇讲到，精准医学不等于高通量测序，但高通量测序是精准医学的支点。
在当今实验室医学时代，70%的以上的信息来自于实验室，没有精准检测，何来精准医疗，所以实验室标准化非常重要，而所谓标准化，则是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。
随即，李主任重点针对高通量测序技术临床应用的标准化和质量管理进行了非常详细的介绍。
主任介绍到，国家卫生计生委医政医管局对高通量测序临床应用试点实验室的管理包括：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室。
因此，2015年临检中心增加了“国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测”质评调查，2016年又新增“染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛”质评计划，以及“肿瘤游离DNA（ctDNA）检测”的质评调查。
接下来，李主任围绕NGS标准化涉及的几个方面分别进行了重点阐述，包括实验室分区设计的标准化，试剂方法的标准化，检测操作的标准化，结果报告与解释的标准化等。
整个讲座分享了很多很有临床应用意义的信息，比如试剂方法的标准化中提到了：NGS性能确认（validation）应该包括分析确认和临床确认，其中o分析确认：精密度（precision）；准确度（accuracy）；分析灵敏度（analytical sensitivity）；分析特异性（analytical specificity）；可报告范围（reportable range）；o临床确认（通过患者人群研究得到）：临床敏感性；临床特异性；阳性预测值；阴性预测值；而检测操作的标准化，谈到了SOP的重要性，李主任提到，有可操作性的SOP及全员遵循是质量管理的“灵魂”！结果报告与解释的标准化中，列举并介绍了NGS检测报告至少需要包括的信息等等。
当然，NGS检测标准化还远不止以上，其它方面如仪器设备正确使用、维护和校准；人员的内部和外部培训及能力评估；室内质量控制（IQC）；室间质量评价（EQA）；质量的持续改进（PDCA）等都很重要最后，主任强调，NGS标准化之所以重要，与现阶段国内NGS开展现状密不可分，目前国内NGS检测存在“三多”“三不够”的问题，所谓三多，即涉及的临床科室多，自配试剂多，检测项目多；而三不够，则是一些基本概念理解不够，SOP可操作性及对遵循SOP理解不够，质量意识不够等。
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化(李金明)
高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化李金明国家卫生计生委临床检验中心全国cfDNA检测标准化高峰论坛2016.11.23-24 长沙基因测序技术的发展●1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ）●1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重叠法）●1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，引物延伸测序）●1975年：加减法DNA测序（英国剑桥大学Fred ）●1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学降解法测序(美国哈佛Alan Maxam &Walter Gilbert）●1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等）●2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454life Science公司的创始人Jonathan Rothberg)●2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被Roche、illumina和ABI公司收购。
新一代测序技术（next-generation sequencing）2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术精准医学不等于高通量测序高通量测序是目前精准医学实践最为成熟的支撑技术高通量测序技术的临床应用●染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT）●胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation GeneticScreening，PGS）和胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD）●肿瘤靶向治疗基因突变检测●单基因遗传病检测●病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组（Metagenomics）测序●┈┈高通量测序技术临床应用的质量管理与标准化●国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试点实验室●2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测●2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18）无创产筛●2016年质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA）检测●2017年正式开展：全国肿瘤基因突变高通量测序（组织样本）检测质评计划批准的第一批四个专业的试点单位全面质量管理？●写你所应做的●做你所写的●记录你已做的●分析你已做的以ISO的标准如ISO15189为标志的！标准化？标准化是对实际与潜在的问题作出统一规定，供共同和反复使用，以在预定的领域内获取最佳秩序和效益的活动。
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电泳区测序区 测序区检测区 检测区扩增区 文库扩增区 （扩增二区） （扩增二区）
杂交捕获区 杂交捕获区 （扩增一区） （扩增区 空气流向 缓冲间 缓冲间 空气流向 缓冲间
试剂准备区
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 缓冲间
空气流向 空气流向 缓冲间
专用走廊
Illumina平台杂交捕获法肿瘤基因突变NGS检测流程举例
• 试剂制备、贮存； • 消耗品准备、贮存
试剂准备
• 核酸提取（磁珠或柱提）及片段化及其检测（组织样本，可单设打断区，检测可在电泳区） • 末端修复和加“A” 标本及文 库制备 • 接头（adapter）连接：连接产物磁珠纯化（加标签index）
标准化的关键点
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检验申请单是合适的：对“Who”在“When”开 出“What”申请单 标本是正确的和好的：采集、运送和保存 实验室环境条件是好的：温湿度、可能的干扰的 避免（分区、灰尘、电磁、振动等） 仪器设备状态是好的：维护、定期校准 试剂是好的：性能验证或性能确认、批质检 实验室人员是有能力的：外部和内部培训，能力 评估 SOP的可操作性及全员遵循 得到结果的过程是有监控的：室内质量控制和室 间质量评价（或实验室间比对） 针对差错、投诉、失控等分析原因采取措施的质 量持续改进 临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾 病的诊断和治疗
精准医学不等于高通量测序
高通量测序是精准医学的支点
标准化？
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实验室医学
实验室医 学的时代！ 没有精准 检测何来 精准医疗？
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70%或90% 以上信息来 自实验室
个体化医学 （personalized medicine) 精准医学 （precision medicine） 移动医疗 数字医疗
预测
诊断
监测
预后
精准医学计划 （Precision Medicine Initiative） 新生儿测序计划（BabySeq P与潜在的问题作出统
一规定，供共同和反复使用，以在预 定的领域内获取最佳秩序和效益的活 动。
质量管理的内涵
l 写你所应做的 l 做你所写的 l 记录你已做的 l 分析你已做的
瓶颈在哪里？
质控结 果分析
结果分析报告
报告发出、用于疾病诊断 治疗
高通量测序技术的临床应用
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染色体非整倍体无创产前筛查（NIPT） 胚胎植入前遗传学筛查（ Preimplantation Genetic Screening， PGS）和胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Dignosis，PGD） 肿瘤靶向治疗基因突变检测 单基因遗传病检测 病原微生物检测：如HPV基因分型、宏基因组 （Metagenomics）测序
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高通量测序技术临床应用的标准化和质量管理
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国家卫生计生委医政医管局高通量测序临床应用试点实 验室：评审标准、评审、试点实验室基本要求、管理试 点实验室 2015年增加质评调查：全国肿瘤诊断与治疗高通量测序 检测 2016年新增质评计划：染色体非整倍体（21、13、18） 无创产筛 2016年即将增加质评调查：肿瘤游离DNA（ctDNA） 检测
引物延伸测序）
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1975年：加减法 DNA测序（英国剑桥大学Fred ） 1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学 降解法测序(美国哈佛Alan Maxam &Walter Gilbert） 1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等） 2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454
涉及临床医生 检测申请单、 标本采集环节 标本采集、 和实验室 运送和保存 （分析前）
结果报告解 释及临床应 用（分析后）
质量保证
室内质控 （分析中）
涉及实验室人 员和临床医生 室间质评 （分析中）
涉及实验室
涉及实验室
实验室分区设计的标准化
产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）
测序区
空气流向 缓冲间 文 库 扩 增 与 检 测区 空气流向 缓冲间 标 本 与 文 库 制 备区 空气流向 缓冲间
NGS检测的常规流程
检测申请单、标本采集、 运送、处理和保存
信 息 系 统
标 本 和 试 剂 准 备
标本接收及质检
扫条码
标本离心、开盖
加样器、核酸提取、建库、 仪器 富集、离心机、温育仪
设备 维护 校准 电泳仪、超声仪、扩增仪、
测序仪等
试剂 方法 的性 能验 证或 确认、 试剂 批质 检
哪些是影响质量的关键环节？
life Science公司的创始人Jonathan Rothberg)
2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被 Roche、illumina和ABI公司收购。新一代测序技术（next-generation sequencing）2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术
试剂准备区
空气流向 缓冲间
专用走廊工作流向标本与制备区扩增与检测区测序区
植入前胚胎遗传学诊断(全基区
空气流向
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
空气流向
缓冲间
缓冲间
专用走廊
遗传病诊断+肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）
高通量测序临床应用的标准化
李金明
国家卫生计生委临床检验中心
基因测序技术的发展
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1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ） 1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重叠法） 1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家，