陈炎-2011-RANK基因干扰序列对小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化及其活性的影响
破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路_黄晓斌
#综述#基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400240)作者单位:300192 天津,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所通讯作者:黄晓斌,Email:HXB19800401@破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路黄晓斌 孙元明 李雨民 杨福军摘要:破骨细胞从起源发育至成熟,再经活化发挥吸收作用是一个复杂的多级调控过程,始终都受到一系列细胞因子的影响。
有些细胞因子对破骨细胞的成熟分化起促进作用,如:RANKL 、TNF -A 、IL -1、IL -6、1,25-(OH)2D 3、PTH 、M -CSF 等,其中RANKL 和M -CSF 是破骨细胞形成和分化过程中的两个必需的因子;有些因子起抑制作用,如:OPG 、IL -4、IL -10、雌激素、降钙素、TGF -B 等。
OPG P RANK P RANKL 系统在破骨细胞分化成熟过程中起着枢纽作用,大部分细胞因子都直接或间接地通过OPG P RANK P RANKL 系统来发挥作用,其中还涉及到成骨细胞、破骨细胞、基质细胞等复杂的相互作用。
介导破骨细胞分化成熟的各种细胞因子反应的信号传导路径主要包括MAPK 、NF -kappaB 、CN P NFAT 等通路,全面地了解破骨细胞因子及其信号传导通路,将有助于临床更好地分析各种骨代谢性疾病的病因及发病机制,进而为治疗提供理论依据。
关键词:破骨细胞;细胞因子;信号转导The cytokines of osteoclast and their path o f signal transduction H U ANG Xiaobin ,SU N Yuanming ,LI Yumin ,et al .Department o f Biomedicine ,I nstitute of Radiation Medicine ,CAMS &PU MC ,Tian j in 300192,ChinaAbstract :It is a complicated process that osteoclast differentiates from progenitor to mature osteoclast which have the function of bone resorption.There are series of cytokines and systemic hormones involved i n this phase.Some cytokines promote osteoclast developmen t,such as RANKL,TNF -A ,IL -1,IL -6,1、25-(OH)2D 3,PTH,M -CSF,and the list will go on,in which RANKL and M -CSF are essen tial.Other cytokines inhibi t osteoclast growth,such as OPG,IL -4,IL -10,estrogen,calcitonin,TGF -B ,and so on.The OPG P RANK P RANKL system is vi tal in the period.Most of cytokines play role through OPG P RANK P RANKL system directly or indi rectly.The interaction between osteoclast and os teoblast or stromal cell i s also important.There are several si gnal path ways such as MAPK,NF -kappaB and CN P NFAT,involved in osteoclast di fferentiation.Understanding the cytoki nes of osteoclast and path of signal transduction respectively make i t possible for us to comprehend the developmen t and the treatment of the bone metabolic diseases.Key words :Os teoelast;Cytokine;Si gnal transduction骨是一不断更新的组织,骨吸收和骨形成的动态平衡维持着正常的骨代谢。
NF_B信号通路与骨质疏松
2 NF-κB 在破骨细胞中的作用 破骨细胞在维持骨吸收和骨形成的动态平衡中起着重要
的作用，而 NF-κB 活化被认为是成熟破骨细胞存活〔15〕和发挥 功能〔16〕的重要调节因子。NF-κB 家族 5 个成员中，NF-κB1 和 NF-κB2 在骨中的作用最早被发现。在 NF-κB1 /2 双基因敲除 小鼠模型中意外地发现这种小鼠不能萌牙，并患有由于缺少破 骨细胞导致的骨骼硬化症〔17，18〕。此外，NF-κB1 /2 双基因敲除 小鼠与 RANKL-RANK 双基因敲除小鼠的破骨细胞分化障碍相 似，它们的破骨前体细胞都停止在分化阶段，并且不能够表达 破骨细胞分化的重要作用因子，如： TRAP、组织蛋白酶 K、降钙 素受体等。正常情况下许多细胞的存活都需要 NF-κB 的表达， 研究发现这种 NF-κB1 /2 双基因敲除小鼠的破骨前体细胞数量 增加，但是凋亡没有增加〔19〕。TNF、LI-1、IL-6 和 RANKL 等细 胞因子能够促进破骨前体细胞向破骨细胞分化，但是这些细胞 因子不能促进 NF-κB1 /2 双基因敲除小鼠的破骨前体细胞分 化〔20〕，而 NF-κB1 和 NF-κB2 的单基因敲除小鼠破骨细胞形成 正常，并且能增加 IL-1 促进破骨细胞形成的作用〔20〕，由此可 见，在破骨细胞中 NF-κB1 /2 主要作用是调控细胞的分化，并且 经典和非经典的 NF-κB 信号通路在 TNF，RANKL，IL-1 等诱导 破骨细胞形成中起着重要的作用。
有实验进一步证实nfb在雌激素维持骨平衡中起着重要作用在成骨细胞mc3t3中17雌二醇对nfb基础活性没有影响17雌二醇明显抑制tnf诱导的nfb说明雌激素能够维持nfb的活性在一个正常的水平从而有利于成骨细胞的增殖分化44正常培养的大鼠成骨细胞上有少量bcl2bax和fas达其表达并不随培养时间的延长而有所变化
RANKL和M-CSF诱导THP-1细胞向破骨细胞样细胞分化的研究
得到更 接 近天然 的破骨 细胞 。
１ 材料 与方 法
质 疏松 等 。 因此 ， 破 骨 细 胞 分 化 和 功 能 的研 究 成 对 为 攻克 这些 疾病 的关 键 。破 骨细胞 由单 核 细胞分 化 而来 ， 体 外 实验 中 ， 采 用 外 周 血 单 核 细 胞 （ Ｂ 在 多 Ｐ． Ｍ ｓ 、 带 血 单 核 细 胞 （ Ｂ ｓ 和 人 类 白血 病 单 Ｃ ）脐 Ｕ ＭＣ ） 核 细胞 系 Ｕ ３ ９ ７和 Ｔ Ｐ１为前体 细 胞 诱 导得 到 破 骨 Ｈ一 细胞样 细胞 。破 骨 细胞分 化需 要两 个 细胞 因子— — 破 骨细胞 生 成 因子 （ Ａ Ｋ ） 巨噬 细 胞 集 落 刺 激 ＲＮ Ｌ和
Ｍ — Ｆ． ＣＳ
Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ：ＴＨＰ １ 一 ；ＲＡＮ ；Ｍ— Ｓ Ｋ Ｃ Ｆ；Ｏｓｅ ｃａ ｔｌ ｅ ｃ ｌ ｔ ｏ ｌ ｓ— ｋ ｅｌ ｉ
很 多 骨骼疾 病 是 由破骨 细胞 的分 化和 功能 异常 引起 的 ， 巨颌 症 、 风 湿性 关 节 炎 、 如 类 女性 绝 经 后 骨
山东 医药 ２ １ 年 第 ５ ０１ １卷第 ３ ３期
Ｒ Ｎ Ｌ和 Ｍ—Ｓ Ａ Ｋ Ｃ Ｆ诱 导 Ｔ Ｐ１细胞 向破 骨 Ｈ一 细 胞 样 细胞 分 化 的研 究
刘天 云
长非编码RNA对骨质疏松症中成骨和破骨细胞分化及功能的调节作用
南昌大学学报(医学版)2021年第 61卷第2期JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2021,Vol61No.289长非编码RNA对骨质疏松症中成骨和破骨细胞分化及功能的调节作用王如梦a,彭山萍b,徐宏(南昌大学基础医学院a.生理学教研室；b.基础医学2019级研究生，南昌330006)摘要：骨质疏松症(OP)是一种多发于绝经后妇女的骨代谢性疾病，因其易导致骨质疏松性骨折严重影响患者的生活质量而受到广泛重视。
成骨细胞介导的骨生成与破骨细胞介导的骨吸收之间的失衡是OP的重要成因。
长非编码RNA(LncRNA)在表观遗传、转录等水平参与调控成骨细胞和破骨细胞的分化与功能等过程，影响OP的发生发展。
本文对LncRNA调节成骨和破骨细胞的分化及功能的作用进行综述,旨在为OP的防治提供新的思路。
关键词：长非编码RNA；骨质疏松症；成骨细胞；破骨细胞；分化；功能中图分类号：R681文献标志码：A文章编号：2095-4727(2021)02-0089-05DOI：10.13764/ki.ncdm.2021.02.019Regulation of Long Non-coding RNA on Differentiation and Function of Osteoblasts and Osteoclasts in OsteoporosisWANG Ru-meng a,PENG Shan-ping b,XU Hong a{a.Department of Physiology; b.Grade2019,Basic Medicine,Basic MedicalCollege of Nanchang University^Nanchang330006?China)ABSTRACT：Osteoporosis(OP)，a commonly metabolic bone disease in post-menopausal women，is a t ached great a t ention worldwide because OP may lead to osteoporotic fracture that seriouslya f ectthelifequalityofpatients.Theimbalancebetweenosteoblast-mediatedboneformationandosteoclast-mediatedboneresorptionisanimportantcauseofOP.Alargenumberofstudieshave shown that long non-coding RNA(lncRNA)participates in regulating the differentiation and functionofosteoblastsandosteoclastsatlevelsofepigeneticsandtranscription，anda f ectsthe occurrenceanddevelopmentofOP.Inthispaper，theroleoflncRNAinregulatingthedi f erentia-ton and function of osteoblasts and osteoclasts is reviewed,with the aim of providing new ideas forthepreventionandtreatmentofOP.KEY WORDS：lncRNA；osteoporosis；osteoblast；osteoclast；di f erentiation；function骨质疏松症(OP)是一种全身性骨代谢疾病，特点是骨量减少，骨组织微结构恶化，骨脆弱性增加,以及随之增加的骨折的高风险。
运动上调GPR48-RANKL通路影响2型糖尿病小鼠破骨细胞分化
运动上调GPR48-RANKL通路影响2型糖尿病小鼠破骨细胞分化陈祥和;孙朋;杨念恩;李世昌;徐会金;张娜娜【期刊名称】《成都体育学院学报》【年(卷),期】2017(043)003【摘要】目的:探究T2DM小鼠OC分化变化及不同力学刺激通过GPR48-RANKL通路对T2DM小鼠OC分化的分子调控作用.方法:40只4周龄雄性C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后随机分为T2DM造模组(30只)和正常对照组(ZC,10只).T2DM造模组小鼠6周高脂膳食结束空腹12 h后注射STZ,2周后检测小鼠血糖,有27只造模成功并将其随机分为T2DM对照组(TC,9只)、T2DM游泳组(TS,9只)和T2DM游泳组(TD,9只),TS和TD组小鼠分别进行8周游泳和下坡跑训练.结束后,取右侧股骨并利用RT-PCR法检测相关因子mRNA表达;取左侧胫骨并利用West-blotting法检测相关因子蛋白表达;取小鼠BMM并诱导其向OC分化,利用TRAP染液对OC染色;取右侧胫骨并利用游标卡尺检测其大小.结果:与ZC 组相比,TC组GPR48、OPG、RANKL、RANK、NFATc2、CTSK的mRNA和GPR48、RANKL、RANK蛋白表达均显著变化(P<0.05或P<0.01),OC数量显著增多,远端冠状面宽度和近端冠状面宽度显著变小(P<0.05).与TC组相比,TS组GPR48、OPG、RANKL、NFATc2、CTSKmRNA和GPR48、RANKL蛋白表达均显著变化(P<0.05或P<0.01),OC数量显著减少;TD组GPR48、OPG、RANKL、RANK、NFATc2、CTSKmRNA和GPR48、RANKL、RANK蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.01),OC数量显著减少,胫骨长度和中间矢状轴宽度显著减少(P<0.05或P<0.01).与TS组相比,TD组OPG和CTSKmRNA及GPR48、RANK、RANKL蛋白表达均显著变化(P<0.05或P<0.01),OC数量显著减少.结论:T2DM 小鼠OC分化显著增强;直接作用力激活T2DM小鼠骨中GPR48-RANKL通路,进而抑制RANK及其下游靶基因表达,抑制OC分化,且其作用效果优于间接作用力.【总页数】6页(P90-95)【作者】陈祥和;孙朋;杨念恩;李世昌;徐会金;张娜娜【作者单位】扬州大学体育学院,江苏扬州225127;华东师范大学体育与健康学院,上海200241;安庆师范大学体育学院,安徽安庆246000;华东师范大学体育与健康学院,上海200241;华东师范大学体育与健康学院,上海200241;海口经济学院拳星时代体育学院,海南海口571127【正文语种】中文【中图分类】G804.2【相关文献】1.有氧运动通过激活PI3K（p110α）／Akt信号通路保护2型糖尿病小鼠心功能[J], 林延艳;赵林双;刘意2.JAK2/STAT3信号通路对RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响 [J], 李常虹;赵金霞;孙琳;姚中强;刘蕊;刘湘源3.高浓度葡萄糖对Notch2信号通路及破骨细胞分化的影响 [J], 段莉;林典岳4.骨保护素对大鼠正畸牙齿移动过程中破骨细胞分化和p38-MAPK信号通路的影响 [J], 娄颖;马欣5.敲除MSTN基因可上调骨骼肌胰岛素信号通路并减轻2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗 [J], 柳杨青;汪艳芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
巨噬细胞成骨相关基因
巨噬细胞成骨相关基因
巨噬细胞成骨相关基因是指在骨代谢中发挥重要作用的基因，其中最为重要的是核因子-kB (NF-kB)、转录因子Cbfa1和RANK/RANKL 系统等。
NF-kB作为一种关键的信号转导分子，在巨噬细胞中起到重要的调控作用，能够促进巨噬细胞成骨分化和骨吸收。
Cbfa1是一种转录因子，也是骨细胞分化的关键因子，能够促进巨噬细胞向成骨细胞的分化。
RANK/RANKL系统是骨吸收的关键调节因子，其中RANKL 是由巨噬细胞和成骨细胞分泌的，而RANK则是存在于巨噬细胞和骨吸收细胞中的受体，能够调控骨重建和骨吸收的平衡。
因此，了解这些巨噬细胞成骨相关基因的功能和调控机制，对于治疗骨代谢相关疾病具有重要的指导意义。
- 1 -。
巨噬细胞炎症实验报告(3篇)
第1篇实验名称：巨噬细胞炎症反应研究实验目的：1. 观察和分析巨噬细胞在炎症环境下的生物学行为。
2. 探究巨噬细胞在炎症反应中的作用及其调节机制。
3. 评估不同刺激条件下巨噬细胞的炎症反应差异。
实验时间：2023年X月X日至2023年X月X日实验材料：1. 小鼠巨噬细胞2. LPS（脂多糖）3. IFN-γ（干扰素-γ）4. 细胞培养箱5. 流式细胞仪6. 检测试剂盒（包括细胞因子、炎症因子等）7. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、抗生素等实验方法：1. 巨噬细胞的分离与培养- 将小鼠巨噬细胞从脾脏中分离出来，并进行培养。
- 培养过程中，加入适量的LPS和IFN-γ，以诱导巨噬细胞的炎症反应。
2. 流式细胞术检测巨噬细胞的炎症反应- 收集培养后的巨噬细胞，进行流式细胞术检测。
- 分析巨噬细胞表面标志物（如CD80、CD86等）的表达情况，以评估巨噬细胞的活化程度。
- 检测巨噬细胞分泌的细胞因子（如TNF-α、IL-6等）水平，以评估巨噬细胞的炎症反应强度。
3. 实验分组- 对照组：仅培养小鼠巨噬细胞，不添加任何刺激剂。
- LPS组：添加LPS刺激巨噬细胞，诱导炎症反应。
- IFN-γ组：添加IFN-γ刺激巨噬细胞，诱导炎症反应。
- LPS+IFN-γ组：同时添加LPS和IFN-γ，诱导更强的炎症反应。
实验结果：1. 巨噬细胞的炎症反应- 与对照组相比，LPS组和IFN-γ组的巨噬细胞表面标志物（如CD80、CD86）表达显著升高，表明巨噬细胞被成功活化。
- LPS+IFN-γ组的巨噬细胞表面标志物表达水平更高，说明同时添加LPS和IFN-γ可以诱导更强的炎症反应。
2. 细胞因子水平- 与对照组相比，LPS组和IFN-γ组的巨噬细胞分泌的细胞因子（如TNF-α、IL-6等）水平显著升高，表明巨噬细胞在炎症反应中发挥了重要作用。
- LPS+IFN-γ组的细胞因子水平更高，说明同时添加LPS和IFN-γ可以诱导更强的炎症反应。
RANK、RANKL与人工关节磨损颗粒诱导骨溶解
RANK、RANKL与人工关节磨损颗粒诱导骨溶解陈德胜;张先龙【摘要】人工关节磨损颗粒诱导的骨溶解是人工关节置换术后无菌性松动的最主要原因.人工关节各个部件相互摩擦产生的磨损颗粒经体内巨噬细胞反复吞噬、刺激产生多种细胞因子和炎症介质.磨损颗粒与巨噬细胞相互作用产生的促炎症反应使破骨细胞过度生成和激活,人工关节周围正常骨质被吸收破坏,最终形成骨溶解和无菌性松动.研究证实,细胞核因子κB活化因子受体(RANK)及其配体(RANKL)在骨溶解中起重要作用.该文就RANK、RANKL结构,生物学功能及其与磨损颗粒诱导骨溶解的关系等近期研究进展作一综述.【期刊名称】《国际骨科学杂志》【年(卷),期】2012(033)006【总页数】3页(P398-400)【关键词】细胞核因子κB活化因子受体;细胞核因子κB活化因子受体配体;无菌性松动;磨损颗粒;骨溶解【作者】陈德胜;张先龙【作者单位】200233,上海交通大学附属第六人民医院骨科;200233,上海交通大学附属第六人民医院骨科【正文语种】中文人工关节置换术作为日趋成熟的外科技术，能达到解除患者关节疼痛、重建关节活动功能并提高生活质量的治疗目的，是晚期骨关节炎、类风湿关节炎及老年股骨颈骨折或各种原因引起的股骨头坏死终末期病变等有效的治疗方法之一。
随着手术技术和人工关节制作工艺的不断提高，组织生物工程学和材料学的进一步发展，人工关节置换术后并发症如感染、人工关节断裂下沉等明显减少。
但人工关节磨损颗粒引起的人工关节周围骨溶解导致的无菌性松动，仍然是影响人工关节长期使用的重要并发症和人工关节失败、返修的主要原因。
磨损颗粒诱导骨溶解是一复杂的病理过程，其中细胞核因子κB活化因子受体(RANK)及其配体(RANKL)起着重要的调控作用。
深入研究RANK和RANKL的调控机制及其与磨损颗粒诱导骨溶解的关系，对于研究人工关节磨损颗粒所致无菌性松动的机制并寻找积极有效的预防和治疗手段有着重要意义。
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DOI ：10．3877/cma．j．issn．1674－134X．2011．03．013基金项目：广东省科技计划社会发展类项目（2008B030301321；2009B030801025）作者单位：510120广州，中山大学孙逸仙纪念医院关节外科（陈炎、许杰、董文武、普热卡什、马若凡）；044000山西省运城市中心医院创伤骨科（董彬）通讯作者：马若凡E-mail ：maruofan_SYX@yahoo．com．cn ·基础论著·RANK 基因干扰序列对小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化及其活性的影响陈炎许杰董彬董文武普热卡什檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸殠殠殠殠马若凡陈炎，在读硕士，2008年本科毕业于苏州大学医学院，同年考取中山大学孙逸仙纪念医院骨外科硕士研究生，师从马若凡教授，主要研究方向为人工关节术后松动的预防和治疗。
参加省、市级课题2项，多次参加全国及省内学术交流。
【摘要】目的建立逆转录病毒介导的沉默小鼠RANK 基因RNA 干扰表达体系，并观察其对小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化的影响。
方法将沉默小鼠RANK 基因短发夹RNA （shRNA ）片段重组到pSuper-Retro 质粒中，构建沉默小鼠RANK 基因RNA 干扰逆转录病毒载体pSUPER-shRANK ，与PIK 包装质粒经293FT 细胞包装后，产生的重组逆转录病毒感染小鼠骨髓巨噬细胞，并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆，用Western blot 检测细胞中RANK 蛋白表达的变化。
对病毒感染的小鼠BMM 和未经感染的小鼠BMM 分别用100ng /ml RANKL 和30ng /ml M-CSF 诱导，9d 后TRAP 染色及扫描电镜观察破骨细胞形成及骨溶解情况。
结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确；逆转录病毒感染小鼠骨髓巨噬细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆；对经病毒感染的细胞进行RANK 蛋白检测发现，RANK 表达较未感染BMM RANK 下降了80.7%（P ＜0.01）；与未感染BMM 相比较，感染BMM 在培养9d 后，TRAP 染色发现核≥3个的破骨细胞数量明显减少，分别为（82.00ʃ4.64）和（6.80ʃ1.64）（P ＜0.05）；扫描电镜的结果显示骨陷窝面积明显减小，分别为（16.60ʃ2.70）%和（2.80ʃ0.84）%（P ＜0.05）。
结论携带沉默小鼠RANK 基因的逆转录病毒感染小鼠骨髓巨噬细胞能明显抑制RANK 蛋白表达，沉默RANK 抑制小鼠BMM 向破骨细胞的分化及其活性。
【关键词】RANK 基因；RNA 干扰；骨髓；巨噬细胞；逆转录病毒科感染The effect of retrovirus-mediated shRNA targeting mouse RANK on osteoclastogenesis of bone marrow-derived macrophages CHEN Yan*，XU Jie，DONG Bin，DONG Wen-wu，Prakash，MA Ruo-fan．*Department of Orthopedics，Sun Yat-sen Memorial Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou510120，ChinaCorresponding author：MA Ruo-fan，E-mail：maruofan_SYX@yahoo．com．cn【Abstract】Objective To construct a retrovirus-mediated expression system containing short hairpin RNA（shRNA）targeting mouse RANK gene，and to study its influence on the osteoclastogenesis of mouse bone marrow-derived macrophages．Methods A recombinant retrovirus vector pSUPER-shRANK was generated by cloning shRNA targeting mouse RANK gene into pSuper-Retro vector．To obtain retrovirus supernatant，pSUPER-retro-shRANK and packaging plasmid vector（PIK）were transfected into293FT packaging cells by calcium phosphate transfection method．BMMs were repeatedly infected by the retrovirus supernatant，and stable BMM clones were generated after screening with puromycin．RANK proteins were then analyzed by Western blot．BMMs and infected BMMs were induced by100ng/ml RANKL and30ng/ml M-CSF for nine days．Osteoclasts and bone resorption pits were detected by TRAP staining and Scanning Electron Microscopy．Results The pSUPER-shRANK recombinant retrovirus vector had been constructed correctly by restriction enzyme digestion and sequencing methods assays．Stable infected BMMs clones were generated after screening with puromycin．The expression of RANK protein in infected BMMs reduced significantly（80.7%），compared with uninfected BMMs （P＜0.01）．Nine days later，there was a reduction in the number of TRAP+multinucleated cells in infected BMMs（6.80ʃ1.64）compared with uninfected BMMs（82．00ʃ4.64）（P＜0.05）．Furthermore there was significant reduction in resorption areas on bone slices in infected BMMs（2.80%ʃ0.84%）compared with uninfected BMMs（16.60%ʃ2.70%）（P＜0.05），indicating profound inhibition of osteoclastic bone resorption．Conclusions The pSUPER-shRANK retrovirus vector showed effective inhibition on the expression of RANK at protein levels；the osteoclastogenesis of BMMs was inhibited by RNAi targeting RANK．【Key words】RANK gene；RNA interference；Bone marrow；Macrophages；Retroviridae infections人工关节假体置换是对关节炎或肿瘤等疾病造成关节破坏而进行重建的最有效方法，但随着假体使用年限的延长，无菌性松动成为最主要的并发症，松动的发生和发展主要为假体活动所产生磨损颗粒介导的破骨细胞骨溶解所致。
已有研究证实磨损颗粒作用下产生的各种炎症因子最终是通过核激活因子受体配体（ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL）/核激活因子受体（receptor activator of NF-κB，RANK）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）信号传导系统和RANK信号通路来增强破骨细胞的分化与活化，最终导致假体周围骨溶解。
RANK在此两种系统的中心作用，已被认为是破骨细胞分化与活化的最重要的信号受体。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是在转录水平上的基因阻断技术，由于其可以简单、有效、特异地下调细胞中靶基因表达，因此是研究基因功能的一种有力工具。
本研究通过利用前期研究中从3对沉默小鼠RANK的干扰序列中选择出最佳干扰序列，进一步研究病毒感染沉默RANK对小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化及其活性的影响。
材料与方法一、材料pSuper-retro-puro质粒购自Oligoengine公司，感受态DH5α购自Invitrogen公司，靶向RANK的shRNA由上海英竣有限公司合成，BglⅡ，Hin dⅢ限制性内切酶购自美国NEB公司、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂和DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；puromycin购自Sigma公司；RANK一抗、HRP标记的IgG二购自Santa Cruz公司。
二、方法（一）靶向小鼠RANK基因shRNA靶序列的设计及合成根据shRNA设计原则及小鼠RANK mRNA序列，针对小鼠RANK基因编码区设计特异性序列共3对shRNA及一对阴性对照序列。
按照pSUPER质粒说明书中构建发夹状短链RNA的原则，设计序列，序列经上海英竣有限公司合成，前期研究中已筛选出shRANK-3为沉默RANK的最佳干扰序列［1］。
（二）重组载体的构建将干扰载体pSuper用BglⅡ和HindⅢ双酶切；将加入T4DNA连接酶后于16ħ过夜与合成好的shRNA连接；用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，涂于含有100mg/L氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，37ħ培养过夜，挑取单菌落，37ħ摇床培养过夜；用质粒微量抽提试剂盒小量制备质粒，经BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定正确后，送上海英竣公司测序。