小鼠骨髓间充质干细胞原代培养概要
间充质干细胞的传代课件
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细胞分裂的维持
总结词
细胞分裂是维持细胞数量的关键，通过维持适宜的生长因子浓度，可以促进间充质干细胞的分裂与增 殖。
详细描述
在传代培养过程中，需要确保生长因子的浓度适宜，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长 因子（EGF）等，以促进细胞的分裂与增殖。同时，还需注意避免细胞过度生长和密度过大导致的细 胞凋亡。
传代培养的定义
传代培养是指将细胞从原代或早期代次培养物中分离出来，继续在体外培养条件 下生长和增殖的过程。
在间充质干细胞的传代培养中，通常使用胰酶处理细胞，使其从贴壁状态脱离， 然后进行分瓶培养。
传代培养的必要性
随着细胞在体外培养时间的延长，细胞会逐渐衰老和分化， 导致其功能和表型发生变化。为了维持细胞的特性和功能， 需要定期进行传代培养。
通过传代培养，可以获得大量细胞用于实验研究、药物筛选 和临床治疗等应用。
传代培养的过程
胰酶处理
将胰酶加入细胞培养液中，轻 轻摇晃培养瓶，使胰酶均匀覆 盖细胞表面。
离心和洗涤
将细胞悬浮液离心，去除上清 液，并用生理盐水洗涤细胞。
准备培养瓶和培养基
选择适当的培养瓶和培养基， 并进行消毒和预处理。
分离细胞
06
实验操作注意事项
实验环境与设备
实验室温度
设备与器材
保持恒定的室温，避免温度波动影响 细胞生长。
确保使用无菌、高质量的实验器材， 如细胞培养皿、培养瓶、移液管等。
实验室湿度
维持适宜的湿度，以防止细胞脱水或 过度湿润。
实验操作规程与安全防护
操作规程
遵循标准的细胞培养操作规程， 包括细胞传代、细胞计数、细胞
02
小鼠骨髓基质干细胞的培养
1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟
1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养
学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森
骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通 过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、 光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。练习血细胞计数器的使用方法 1 材料与方法
1.2.3取 1 月龄小白鼠 1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,
1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟
可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*104
2.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，
3.注意事项：
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞（BMSCs）是一种多能干细胞，具有广泛的分化潜能和免疫调节作用。
BMSCs可以通过共培养的方式与其他细胞相互作用，从而影响它们的生长、分化和功能。
共培养是指将两种或更多种不同类型的细胞放在同一培养皿中，让它们相互作用。
BMSCs与其他细胞的共培养可以通过直接接触或间接接触的方式进行。
直接接触是指BMSCs与其他细胞直接接触，而间接接触是指BMSCs释放的细胞因子通过介质传递到其他细胞中。
BMSCs与其他细胞的共培养可以产生多种效应。
首先，BMSCs可以促进其他细胞的增殖和分化。
例如，BMSCs与神经元的共培养可以促进神经元的生长和分化，从而有助于神经再生和修复。
其次，BMSCs可以调节其他细胞的免疫反应。
BMSCs可以通过释放细胞因子来抑制其他细胞的免疫反应，从而减轻炎症和自身免疫性疾病等疾病的症状。
此外，BMSCs还可以促进其他细胞的代谢和功能。
例如，BMSCs与心肌细胞的共培养可以促进心肌细胞的代谢和收缩功能，从而有助于心脏功能的恢复。
BMSCs与其他细胞的共培养是一种重要的细胞学研究方法，可以用于研究细胞间相互作用的机制，以及开发新的细胞治疗方法。
未来，我们可以进一步探索BMSCs与其他细胞的共培养的机制和效应，以期为临床治疗提供更有效的细胞治疗策略。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
骨髓间充质干细胞MSCs培养方案
骨髓间充质干细胞培养方法大鼠骨髓间充质干细胞培养方法仪器和材料磁力搅拌器电子天平水浴振荡器pH计真空泵离心机血球计数板1 x 100ml量筒1 x 1L 容量瓶1 x 500ml玻璃烧杯2 x 500ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 100ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 0.22um 无菌滤膜2 x 100mm 无菌培养皿4 x T25 无菌培养瓶4 x 15ml 无菌离心管2 x 转子2 x 5ml 无菌移液管1ml 无菌枪头封口膜脱脂棉3 x 手术剪2 x 直头镊子1 x 骨钳2 x 手术刀（刀柄+刀片）1 x 100ml 塑料烧杯（盛废液）2 x 100ml 玻璃烧杯低糖DMEM培养基粉末胎牛血清PBS双抗75%酒精SOLUTION PREPARATION溶液制备所有的水溶液均用二蒸水配制。
∙先将试剂在烧杯中用少量二蒸水溶解，然后补加至最终体积。
∙用容量瓶配制溶液。
原代培养：密度梯度离心法1)取鼠龄3-4w，体重70-120g的SD大鼠3-4只（雌雄不限）；2)将SD大鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有约300-500ml 75%酒精的1000ml烧杯中浸泡5min；3)用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用5-10ml 75%酒精浸泡5min后移入超净工作台中；4)用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS和无血清培养基冲洗2~3次后，移入另一无菌培养皿中。
用镊子和骨钳固定股骨，分别用10mL 注射器在骨两端钻孔；5)用5ml（或1ml）注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2~3次；6)在15ml离心管中加入5mL Ficoll分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2：1；7)将离心管以2000rpm离心20min，离心后管内物质分为三层，用吸管小心吸取中间的白膜层置于一个新的离心管内；8)在此离心管中加5ml培养基，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min，离心后用吸管吸去上清液并去掉，加入完全培养基，并轻轻吹散细胞10~20次，制成细胞悬液；9)以5×106cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）, 置于CO2培养箱中培养，48h后用吸管吸出全部培养液并去掉，添加新鲜培养液，以后每隔三天全量换液一次。
骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性
Ｌ Ｕ ＪＡ ｉ ｔｌ Ｉ Ｉ ｑ ａ ｅ （ ｄ ｎ ｎ ｄｃｌ ｎ ｅｓｙ Ｍｕａｊ ｇＣ ｉａ Ｍｕ ａｊ ｇＭｅｉａ Ｕ ｉ ｒｉ ， ｄｎｉ ｈｎ ｉ ｖ ｔ ｎ １７ １ ） ５ ０ １
［ ｂｔ ｃ］ Ｏ ｊｃｖ ：ａｂｎ ｍ／ Ｗｍ ｓｎｈｍ ｌｔ ｌ （ Ｍ Ｃ ） ｅ ｏ ｔ ｄ ｕｕ ｄ ｎ ｒｅｔｉ ｅ ｉ ｔｔ ｏ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅｔｅＲ ｔ ｏｅ ｓＯ ｅ ｃｙ ａｓ ｍｃ ｌ Ｂ Ｓ ｓ ｗｒ ｉｌｅ ａ ｌｒ ｄｒｏｎ ｓｇ ｅｈ ｂ － ｉ Ｔ ｅ ｅ ｅｓ ｅｓ ａ ｄ ｎ ｃ ｔｅ ｉ ｏ ｖ ｔａ ｅ ｉ
ｌｇ ｃ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓ ａ ｄ ｏ ｅ ｒ ｄ ｍｉａ ｔｔｒ ｅ ｅｌ ｆ ｒ ｔ ｓ ｅ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ ｇ ｎ ｎ ｉｅ ｒ ｇ Ｍ ｅ ｈ ｄ ： ＭＳ ｓ ｗ ｒ ｕ ｔ ｒｄ ｏ ｉ ａ ｃ ａ ａ ｔｒ ｉ ｎ ｆ ｒ ｐ ｅ ｏ ｎ ａ ｇ ｔｃ ｌ ｏ ｉ ｕ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｎ ｅ ｅ ｅ ｇｎ ｅ ｉ ． ｌ ｓｃ ｎ ｓ ｓ ｎ ｔ ｏ ｓ Ｂ Ｃ ｅｅ ｃ ｌｕｅ
骨 髓 间充 质 干细胞 的培 养及 生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 学特 性
刘嘉祺 林
（ 牡丹江 医学院
峰
李孟全
牡丹江 １７ １ ） ５ ０ １
黑龙江
【 摘 要】 目的： 分离、 培养大鼠骨髓间充质干细胞（ Ｍ Ｃ）探讨其生物学特性， Ｂ Ｓｓ， 为组织工程和基 因工程提供优势靶细胞。
方法 ： 骨髓 细胞贴壁 法进行 Ｂ Ｓ ｓ 全 Ｍ Ｃ 的原代培养 ， 倒置相差显微镜 观察 细胞 形 态， 流式 细胞 仪检 测 Ｂ Ｓｓ 面抗原 ， Ｔ 法 ＭＣ表 Ｍ ｒ 检测 Ｂ Ｓｓ 殖能力， ＭＣ增 并绘制生长 曲线。结果 ： 原代培养 ２ｈ ４ 后看见 少量贴壁细胞 ， 为小圆形 ，ｄ 可见梭 形类似 成纤维 初起 ３后 细胞 ， 涡样 生长， ３— 代细胞均一性 良好 ， 代 以后 细胞逐渐有 宽大梭形样 变， 呈漩 传 ６ ｌ ０ 增殖减慢 ， 偶有 细胞漂 浮、 亡。流 式 死 细胞仪检测传 ３ 代细胞 Ｃ ２ 表达率为 ９％ ，Ｄ４几乎无表达 。生长曲线显示 ， ３６ Ｂ Ｓ ｓ Ｄ９ ２ Ｃ３ 传 、 代 Ｍ Ｃ 有较 强的增殖 能力， 中传 其 ６代细胞更为明显 ， １ 传 ０代细胞的增殖能力较 前有所减弱。 结论 ： 成功从 大鼠骨髓组织分离、 培养 Ｂ Ｓｓ纯度 高， Ｍ Ｃ， 生物学特性 符合正常干细胞生长规律 ， 组织工程和基 因工程理 想的靶 细胞 。 是
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【摘要】BACKGROUND: The orphan nuclear receptors Rev-erbα and Rorα play important roles in lipid metabolism and glucose metabolism. But it is unclear whether they are involved in bone metabolism. OBJECTIVE: To observe the expression of Rev-erbα and Rorα during the osteoblastogenesis process of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: BMSCs were isolated and purified from C57BL/6 mice by the whole bone marrow adherence method followed by morphology observations and then BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. We detected their differentiation abilities using oil red O staining and alizarin red staining, respectively. Real-time PCR and western blot assay were conducted to detect the mRNA and protein levels of Rev-erbα and Rorα in BMSCs cultured in the osteogenic medium for 0, 7, 14 days. RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs fromC57BL/6 mice were mainly spindle-shaped and exhibited the swirl-like pattern of growth. Following induction, oil red O staining and alizarin red staining produced a positive reaction in these cells. Rev-erbα expression at both gene and protein levels decreased at 0, 7, 14 days after osteogenic induction, while Rorα expression increased at both gene and pro tein levels. These findings indicate that Rev-erbα and Rorα may participate in the osteoblastogenesis of BMSCs.%背景:孤儿核受体Rev-erbα及Rorα已经被广泛证实与糖代谢、脂肪代谢等密切相关,但与骨代谢的关系尚不明确.目的:探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用.方法:采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察和成脂、成骨诱导分化,采用油红O染色,茜素红染色对其分化能力进行鉴定.在骨髓间充质干细胞成骨诱导分化第0,7，14天,采用Real Time PCR及Western Blot分别检测孤儿核受体Rev-erbα及Rorα的mRNA及蛋白表达变化.结果与结论:①骨髓间充质干细胞形态以梭形为主,呈典型的漩涡样生长.油红O染色及茜素红染色呈阳性;②在成骨诱导的第0,7,14天,Rev-erbα的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势,而Rorα的mRNA及蛋白表达均呈上升趋势,提示Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中可能发挥了一定的作用.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)017【总页数】6页(P2625-2630)【关键词】干细胞;骨髓间充质干细胞;成骨分化;核受体;Rev-erbα;Rorα【作者】林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【作者单位】西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学公共卫生学院,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市646000;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院正畸科,四川省成都市 610041【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：Rev-erbα：又名Nr1D1，是孤儿核受体超家族中的一员，Rev-erbα基因位于人类第17号染色体上。
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一、立题依据
1、小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的意义
有利于进行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究
为下一步的传代培养创造条件
可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用 的前提
2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法
贴壁培养筛选法 密度梯度离心法
3、骨髓间充质干细胞的应用前景
在适当的条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为三个胚层来源的组织细胞 而进行细胞移植的治疗，在体外培养扩增后也可种植于生物材料上，回植 入机体修复组织损伤。 骨髓间充质干细胞在治疗组织器官退行性疾病、遗传缺陷性疾病和基因治 疗方面也展现了美好前景。
二、材料和方法
结果一
第1次换液后5～7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形 梭态呈形、三角形或星形 （图1C、D）
结果一
原代细胞培养10 d左右，细 胞快速增殖，每个集落中的 细胞不断增殖呈长梭形放射 状排列（图1E）
培养2周左右，每个小集落形 成约数百致上千个细胞的大 集落，集落交界处出现重叠 、融合 （图1F)
Percoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细
胞
贴壁培养骨髓间充质干细胞
形态学观察
原代培养细胞
生长曲线的测定
三、结果
（一）骨髓间充质干细胞的形态学观察ห้องสมุดไป่ตู้
24 h后就见有细胞贴壁，多数细 胞呈圆形 （图1A）
72 h后首次半量换液去除未贴壁 细胞，此时贴壁的细胞为单个， 形态大部分为圆形 （图1B)
讨论
• 有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCs，可能与冲洗骨 髓腔的操作有关。骨髓MSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶 也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCs外，还混杂着
一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并
非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，已引起 细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一般以5%～
2、仪器
• 倒置显微镜尼康TE2000E（上海于欣仪器有限公司） • CO2恒温培养箱MC0-15A(日本三洋电机楳氏会公司)
• 超净工作台SW-CJ-2F（苏州安泰空气技术公司）
• 生物显微镜（舜宇公司）
• 低温高速离心机（Jouan公司)
• 无菌操作台，血球计数板，6孔培养板等
3、方法
骨髓的收集
图1.倒置显微镜下骨髓间充质干细胞原代培养形态观察 Fig.1 Morphology of BMSCs in primary culture under an inverted microscope (A)1d,×100;(B)3d,×100;(C)5d,×200;(D)7d,×200;(E)9d,×400;(F)13d,×400.
1、材料
成年小白鼠4只 胎牛血清（杭州四季清公司） L-DMEM (Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司 ） 胰蛋白酶（Sigma公司） PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml) Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5) 青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml链霉素） 8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）
谢谢大家
10%胎牛血清最适合MSCs的生长。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触
抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一般适宜 密度为（48）×104个/ml。
五 结论
本实验通过对成年小白鼠骨髓MSCs进行分离，体外培养， 同时从细胞形态和生物学特性进行观察和检测，认为采用淋 巴细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结 合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSCs，具有操作简单， 快速，实用等优点，为一种较为有效的分离纯化骨髓 MSCs的方法。
结果二
（二）原代小鼠骨髓MSCs的生长曲线结果
BMSCs原代培养生长曲线（图2），生长曲线表明BMSCs的增殖能力 很强，所测细胞在开始的前4天里生长缓慢处于潜伏适应期，第5 天开始迅速增长进入对数生长期，到第9天细胞数轻度上升，第10 天达到顶点，生长速度减缓进入平台期。
四
讨论
• 分离骨髓MSCs的方法主要有四种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁 珠分离法、流式分选法等。我们使用密度梯度离心和贴壁筛选法相结合， 能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快 速，对细胞的活性影响较小。且此分离法简单经济，因而被广泛应用。 •据本实验培养细胞的经验，如果操作中吸取界面层细胞不小心，会混进非单 核细胞，就会大大降低细胞分离的纯度，使分离出的细胞大小不均。另外， 细胞分离操作时间延长，操作不轻柔，分离出的细胞纯度降低，都会降低细 胞的贴壁率和存活率。