大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠骨髓间充质干细胞分离培养标记及向移植肺趋化的实验研究
清（ 美 国 Ｈｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ公 司） ， ＤＡＰ Ｉ 试剂（ 美国Ｓ ｉ ｇ ｍａ公 司） ， Ｃ Ｄ３ ４ Ｆ Ｉ ＴＣ 抗 体 （ 美 国 Ｓ ａ ｎ ｔ ａ Ｃ ｒ ｕ ｚ公 司 ） 、 Ｃ Ｄ ４ ４ 一 Ｐ Ｅ抗 体 （ 英国 Ｓ Ｅ ＲＯ ＴＥ Ｃ公 司 ） ， Ｃ Ｄ１ １ ｂ — Ｐ Ｅ
１ ． ２ ． １ ＭＳ Ｃ的分 离 、 培 养 及 鉴 定 全 骨 髓 贴 壁 法 分离培 养 ＭＳ Ｃ ｓ 。取 大 鼠 股 骨及 胫 骨 ， 骨髓细胞 以 ２ ×１ ０ ｅ ｍ 密度 接 种 ， 使用低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 。通
高度 增殖 的能 力 。１ ９ ７ ６年 由 Ｆ ｒ ｉ ｅ ｄ ｅ ｎ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ发现 并描
ＭＳ Ｃ ｓ 向移植肺的趋化现象 。 方法 全 骨 髓 贴 壁 培 养 法 分 离 培 养 大 鼠 ＭＳ Ｃ ｓ ， 流 式 细 胞 法 检 测 细 胞 表 型 。 观 察
包括细胞形态学 、 生长 曲线 在 内 的生 物学 特 征 。通 过 定 向诱 导 ＭＳ Ｃ ｓ向 成 骨 和 成 脂 肪 分 化 鉴 定 其 多 向分 化 潜 能 。
发 现 ＭＳ Ｃ ｓ 在肺缺 血再 灌注 损伤 、 急性 心肌梗 死 、 急 性 肝功 能损 伤 、 脑梗死等组织损 伤修复方面 ， 优 势
显 著 。 ］ 。 目前 研究 发 现 ＭＳ Ｃ ｓ 具 有 分 化 为 脂 肪 细 胞、 成 骨细 胞 、 心肌细胞、 软骨细胞、 肝 细 胞 以 及 神 经细 胞等 多种 类型 细 胞 的潜 能 ， 已 成 为重 要 的 组织 工程 种子 细胞 。本 实验 对 ＭＳ Ｃ ｓ 进 行分 离培养 及 表 型 鉴定 ， 并应 用 Ｄ ＡＰ Ｉ 和 Ｇ Ｆ Ｐ双 重标记 观 察其 能 否 趋 化到 同种 异体 移植 肺 内。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
骨碎补提取物对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及Cbfα1表达的影响
Ｕ Ｇｕ ｏ — ｙ ａｎ ．ＸＵ Ｚｈ ａ ｎ— ｗａ ｎ ｇ．ＸＵ Ｗａ ｎ． １ ｉ
（ １ Ａ ｆ ｉ ｆ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆＳ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｆ ｏ Ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｊ ｉ ｎ ａ ｎ ２ ５ ０ ０ １ ４ ， Ｐ ．Ｒ ．Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分离、鉴定与培养
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。
用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。
用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。
大鼠BMSCs的体外分离培养和鉴定
在使用的血清浓度问题上 ，国内外不 同的实验室所 用并
贴壁生长的特性 ，通 过换 液去 除不贴 壁的其 它杂 质细胞 后 ， 不一致 ，报道多在 ５％ 一２０％之间Ｌ 一 。虽然也有人对 比过
获得呈梭形 的贴 壁 干细胞 。之 后人 们采 用密度 梯度 离心 法 不同浓度血清对所培养 ＢＭＳＣｓ的影响 ，但 因实验条件 和所 使
ｍｉｌｌ。无菌条件下取 出双侧股骨 ，去除 附带组织 ，两端剪 断暴 露骨髓 腔。以 １ ｍｌ注射 器吸取低 糖 ＤＭＥＭ细胞培养 液反复 冲洗 ，至骨质发 白为止 ，将所 收集 的细胞悬 液用 ２０Ｏ目滤 网 过滤 ，制备成单 细胞悬 液。细胞计 数后 以 １．０×ｌＯ６／ｎａ接种 到含 加％胎 牛血清 的低糖 ＤＭＥＭ细胞培养液 的培养瓶 内。 １．３ 骨髓问充质干细胞的传代培养和扩增
一
ｌ８４０ 一
［１］劳业 兴 ，张冰若 ，苏薇薇 ．松针化学成分及药理学研究进 展［Ｊ］．中 药 材 ，２０Ｏ３。２６（９）６８１．
［２】张 霞 ，孙爱东 ．松 针提取 物的研 究进展 ［Ｊ】．中国食物 与营养 ， ２００９，９（９）：２３．
［３］ＷａｎｇＣ，Ｌｉ Ｊ，ＣｈｅｒｔＬ．Ａｍｅｔｉｏｔ＇ａｔｉｖｅｅｆｅｃｔ ｂｅ由既ｉｎｅ∞ ｅｎｄｏｄｌｄｉａｌ由ｓ－ ｆｌｌｎ￣ｏ［１ｉｎｄｉａｂ ｃ ｒａｔｓｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｈｉｇｈｄｉｅｔ ａｎｄａｘｑ，ｔｏ￣ｔｏｄｎ［Ｊ］．ＥｕｒＪ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０Ｏ９，６２０（１—３）：１３１．
即增殖期 。
２．３ 向成 骨 细 胞 诱 导 结 果
诱导培养后 ，细胞变 为多角形 、不规则形 ，胞 浆 中含 有较
多颗粒 ，部分细胞聚集成集落 ，碱性磷酸酶染色呈 阳性 （图 ２）。
改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究
ｗｅ ｅ ｏｂ ｅ ｖ ｄ Ｔｈｅ ｇ ｏ ｈ ｃ ｒ ｅ ｏ Ｓ ｎ ｄ ｆｅ ｅ ｏｎ ｅ ｒ ｔｏｎ ｏ ｅ ａ ｏ ｉ ｅ ｕ （ ｒ ｓ ｒ ｅ ． ｒ ｗｔ ｕ ｖ ｆ Ｍ Ｃｓ ｉ ｉｆ ｒ ｎｔｃ ｃ ｎｔａ ｉ ｆｆ ｔ ｌｂ ｖ ｎｅ ｓ ｒ ｍ ＦＢＳ）ｗａ ｂ— ｓｏ
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改 良法 分 离 培 养 大 鼠 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 的 实 验 研 究
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骨髓间充质干细胞培养方法大全
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。
在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。
本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。
BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。
近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。
BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。
细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。
其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。
本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。
具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。
细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。
细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。
细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。
通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。
通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。
经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。
在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。
这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。
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大鼠的骨髓间充质干细胞提取
第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。
心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。
老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。
雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。
Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。
②我个人认为引颈处死不人道。
麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。
如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。
③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。
浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。
就当初步的消毒吧！
④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。
老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。
一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。
第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。
⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。
将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。
⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。
心得体会：
①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。
②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。
冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。
培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。
③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。
无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。
④以上的细胞生长液5ml具体配制为
DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计)
低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
胎牛血清（HYCLONE公司的，500ml一瓶，大约3600元）浓度为10%，5ml细胞生长液中大约需要0.5ml
L-VC(自己配) 浓度为50ug／ml，5ml细胞生长液中大约需要 25ul
青链霉素(HYCLONE公司的，100ml一瓶，大约190元) 浓度为10万U／ml，5ml细胞生长液中大约需要5ul
至于NaHCO3，一般是加的，浓度为7.5%，使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间，但是我不加，因为在细胞生长中会大量产生含N的分泌物，最好先拿试纸测一下。
再者在5ml细胞生长液中L-VC和青链霉素太少，可以忽略不计，但只是在配小剂量的范围内，大剂量的话就要酌情改变。
第三步：细胞计数。
①从装有5ml细胞悬液的无菌容器中吸取20ul细胞悬液滴到一个培养皿。
②用0.2ml的枪头吸取170ul的生理盐水，滴到20ul细胞悬液上③抽取10ul的4%台盼蓝液滴到盐水和细胞悬液的混合液体中，用枪头在这三者的混合液中抽吸几次，充分搅匀。
④抽取混合液中17ul点到放有载玻片的一个计数池中，刚好填满。
开始计数并算出细胞数数量及浓度。
并按浓度分装到培养皿中。
心得体会：①计数的这个培养皿可以是污染的，只要看的干净就行。
②混合的液体为20+170+10=200ul。
其中细胞悬液的浓度为10%，也就是说细胞悬液被稀释了10倍（也可以稀释至20倍，稀释的越多，更容易数清楚，但误差也随之增大）。
③计数公式 : 细胞数×104／ml=（四个大方格细胞数÷4）×稀释倍数×104／ml 比如，你数了四个大方格中有拒染细胞400个，那么根据公式算出
（400÷4）×10×104／ml = 1×107／ml，现在有5ml的细胞悬液，也就是有1×107／ml ×5= 5×107 个细胞。
当然这么多细胞，不全是我们需要的骨髓间充质干细胞，还有很多其他像红细胞之类的，所以这就要设计到以后的换液纯化了。
④按6-8×l06/ml的浓度接种，故 5×107 ÷ 6-8×l06/ml = 8.3 – 6.25 ml 。
因为一般60mm 的培养皿承载最多5ml的液体，故将5ml的细胞悬液再加入3ml的细胞生长液稀释成
8ml的细胞悬液，各取4ml分装至两个60mm的培养皿。
此刻每个培养皿的细胞浓度为：（5×107）÷8 =6.25×l06/ml,正好在要求的接种密度6-8×l06/ml范围内。
⑤将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。
第四步，48h后半量更换细胞生长液。
以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培养皿约80%时可进行传代，大约周期为7天。