小鼠间充质干细胞分离培养与纯化
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
发育生物学实验指南简要
实验一小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法。
2．了解小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法。
3．了解小鼠骨髓间充质干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：SD大鼠。
2．主要试剂：胎牛血清（FBS），DMEM--LG培养基，PBS，抗体（NSE和GFAP）。
3．主要器材与仪器：手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，培养瓶，培养皿，称量瓶，刻度离心管，吹打管，注射器，倒置相差显微镜，CO2培养箱三、实验步骤1．小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSC)的分离培养:⑴小鼠BMSC的分离和原代培养：①以颈髓离断法处死小鼠。
在无菌条件下取出小鼠股骨，除去骨表面附着的组织，用PBS 清洗干净。
②用剪刀去除股骨两端，暴露骨髓腔。
无菌条件下用5ml注射器抽取PBS约3-4ml将小鼠股骨内的骨髓冲出，收集骨髓冲洗液，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。
③收集细胞悬液约7ml并将其转入15毫升离心管中，1500r/min离心5min，弃上清液及脂肪层。
④在细胞沉淀中加入5-6ml含10%胎牛血清的DMEM一LG培养基，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。
2. 带学生在电脑上观看以往的小鼠间充质干细胞免疫荧光图片。
实验二大鼠神经干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握大鼠胚胎神经干细胞的分离培养方法。
2．了解大鼠胚胎神经干细胞的鉴定方法。
3．了解大鼠胚胎神经干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：孕龄约15天的Wistar或SD孕鼠2．试剂：条件培养基(DMEM/F12+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+20μl/mlB27)，D-Hank’s液(NaCl 8g, KCL0.4g，Na2HPO4.12H2O 0.1g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, 加水1000ml溶解，调PH 值为7.2－7.4，高压灭菌后，4℃储存备用)，0.25％胰蛋白酶（D-Hank’s液配制，过滤灭菌，-20℃储存），抗体(巢蛋白、NSE、GFAP)。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
LacZ转基因小鼠间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究
LacZ转基因小鼠间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究毛飞;高硕;钱晖;朱伟;严永敏;孙靖;许文荣【摘要】目的分离培养LacZ转基因小鼠骨髓间充质干细胞(LacZ-MSC),研究其生物学特性.方法用全骨髓贴壁法分离LacZ-MSC,体外扩增,并观察细胞生长特性,流式细胞议检测细胞周期,成骨成脂诱导试验分析LacZ-MSC转分化特性,X-gal染色法检测其LacZ基因的表达.结果 LacZ-MSC培养4d后有散在呈针尖状的贴壁细胞,5～8d后形成集落或融合呈纤维状;体外扩增每只小鼠原代可获得(1～3)×105个细胞,10代可获得(1 ～3) ×1O10个细胞总数,10代后的细胞增殖能力下降;细胞周期分析显示,G0/G1期:占78.44％,G2/M期:占5.20％,S期:占16.36％;成骨成脂诱导试验表明,LacZ-MSC细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能;X-gal染色结果表明,LacZ-MSC细胞携带LacZ基因.结论从LacZ转基因小鼠骨髓中成功地分离了携带有LacZ基因的MSC,在体外具有较好的增殖更新能力,3～ 10代的LacZ-MSC作为组织工程细胞具有广阔的应用前景.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)007【总页数】3页(P542-544)【关键词】间充质干细胞;细胞增殖;骨髓;LacZ基因【作者】毛飞;高硕;钱晖;朱伟;严永敏;孙靖;许文荣【作者单位】江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江212013【正文语种】中文【中图分类】R329.2间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是最早由Friedenstein报道的一种来源于中胚层和外胚层的成体干细胞，易贴附于塑料培养板表面，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。
以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞
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重庆医科大 学学报 ２ ０ ０ ９年第 ３ ４卷第 ４期 （ｏ ｒａ ｏ ｈ ｎ ｑｎ ｄｃ ｌ ｎｖ ｒｉ ０ ９ ＶＯ．４Ｎｏ４） Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ｏ ｇ ｉ Ｍｅ ｉ ｉｅｓｔ ２ ０ ． １ ． Ｃ ｇ ａＵ ｙ ３
一
３３ 一 ９
基础研 究
文 编 ０ ３ ６ （ ０） — ９ ０ 章 号： ５ ３ ６ ０ ０ ０ ３ ４ ２— ２２ ９４ ３ —
Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ． ｌ ｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｈ ｄ ｉ ｐ ｃ ｌ ｒ ｈ ｌｇｃ ｌ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓｓ ｃ ｓ ｎ ｓｌ ｅ ｃ ｌｎ ｅ ，ｏ ｎ ｒｅｌ ｔ ， ｉ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ：１ ａ ｌ ｈ Ｓ ｃ ｌ ａ ｔ ｔ ｉａ ｐ ｏｏ ｉａ ａａ ｔｒｓ ｃ ｕ ｈ ａ ｅ ｔｋ ｏｏ ｉｓ ｒ ｕ ｄ ｏ ｌ ｐ ｉ ｗ ｔ ｓ ｓ ｓｙ ｍｏ ｃ ｉ ｉ ｉ ｃ ｈ ｃｅ ｒ ｄ ｅ ａ ｄ ｓ ｏ ｈ ｓ ｒａ ｅ，ｔ ｎ ｅｒ ｃｉ ｎ ，ｉ ｎｆ ａ ｔ ｗｅｌ ｇ ｇ ｏ ｈ， ｏ ａ ｔｅ ｓ ｆ ｅｌ ｇ ｒｇ ｔ ｎ ａ ｄ ｉ ｄｓｉ ｃｉｎ ｂ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｌａ ｇ ｎ ｍｏ ｔ ｕ ｆ ｃ ｓｒ ｇｒ ｆ ｔ ｅ ｏ ａ ｏ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｌ ｎ ｒｗｔ ｃ ｍｐ ｃ ｎ ｓ ｌ ａ ｇａ ａ ｉ ｎ ｉｔ ｔ ｅ ｗ ｅ ｉ ｓ ｉ ｏｃ ｏ ｎ ｎ ｏ ｗ ｅ ｇ ｓｏ ｅｇ ｂ ｕ ｅｌ ｗｉ ｉ ｏｏ ｙ ｒ ｌｔ ｅｙｂ ｇ ｅ ｕ ｌａ ｏ ａ ｅ ｔ ｉ ｌ ｃ ｔｐ ａ ｍ ，．．ｈ ｇ ａｉ ｆ ｈ ｕ ｌａ － ｙｏ ｌｓ ； ｄ ｅ ｆ ｉｈ ｏ ｒｃ ｌ ｔ ｎ ａｃ ｌｎ ，ｅａｉ ｌ ｉｇ ｒ ｃ ｅ ｒｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉ ｌ ｔ ｙｏ ｌｓ ｉ ， ｉｈ ｒ ｔ ｏ ｅ ｎ ｃｅ ｒ ｃ ｔｐ ａ ｍ ｎ ｓ ｈ ｖ ｎ ｈ ｔｅ ｅ ｏ ｔ ２ ａｔｒｔｅ ＡＫＰ ｓａｎ ｎ ａｌ ｆ ｈ ｅｌ ｈ ｗｅ ｔｏ ｇ ＡＫＰ ａ ｔ ｉ ｓ ｓ ｍｅａ ｈ Ｓ ｃ ｌ ｆＦ ａ ｄ ｏ ｅｃ ｎ ｒ ｒ ｔ ｅｅ ｒ ｏ ｉ ． ｅ ｆ ｈ ｔｉ ｉｇ， ｌ ｏ ｅＥＳ ｃ ｌ ｓ ｏ ｄ ｓｒ ｎ ｔ ｓ ｃｉ ｔ ａ ａ ｓｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｏ ０， ｎ ｎ ｔ ｏ ｔａｙ， ｍｂ ｎ ｃ ｖｙ ｓ ｈ ｈ ｙ
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
小鼠真皮间充质干细胞的体外培养和标记
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小鼠间充质干细胞
一、细胞复苏和接种
1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、细胞换液和培养
注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞
1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，
用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：
（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。
1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
（3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。
（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。
（5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。
（6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。
（7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。
四、细胞传代
1．消化细胞（详见第三步）。
2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。
3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增
断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。
当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜
下控制消化时间,计数细胞，以1:3密度扩增培养。
此时标记为P1代，以后每３-４ｄ换液１次；当细胞生长融合达80%-90%时，继续以1:3的密度传代扩增培养，传代培养并记为P2代。
倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。