小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
２ ０ １ ３年 ４月
第１ ７卷
第４
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文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ —０ ６ ４ ７ —０ ４ ．
小 鼠骨 髓 间充 质 干 细胞 的体 外 分 离 培 养 和 鉴 定方 法 学 探讨
无 菌条 件 下 分 离 处 死 后 取 小 鼠双 下 肢 骨 ， 低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 液 冲 出骨 髓 ， 离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ｓ ， 用５ ｍｌ 含 １ Ｏ
胎 牛 血 清 的低 糖 ＤＭＥ Ｍ 培养液重悬 细胞。加入等体积密度为 １ ． ０ ７ ３ ｇ ／ Ｉ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ １ 分离液离心 ３ ０ ｍｉ ｎ ｓ 。取 中层 云雾 状 细 胞 。３ ７ ℃、 ５ Ｃ Ｏ 培 养箱 中 贴 壁 培 养 。取 ５ ～ １ Ｏ代 细 胞 培 养 至 对 数 生 长期 后 ， 洗 涤 离 心 。取 １ ０ ０ ｌ 细 胞 悬 液 分 别 加
Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ — ｙ ｕ ｅ 。 Ｃ ＨＥＮ Ｓ ｕ — ｐ ｉ ｎ ｇ ， ＤＩ ＮＧ Ｊ ｕ ｎ — ｌ ｉ ， ｅ ｔ ａ １ ． （ １ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ， ２ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｐ
ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ， ｆ ｉ ｎ ｄ ａ ｂｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｔ ｏ ｓ ａ ｔ ｉ ｓ ｆ ｙ ｔ ｈｅ ｉ ｒ ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎｄ ｑｕ ａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄｓ Ｔ ｈｅ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｋｉ ｌ ｌ ｅ ｄ ｕ ｎ—
小鼠间充质干细胞分离培养与纯化
小鼠间充质干细胞一、细胞复苏和接种1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、细胞换液和培养注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。
1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
ICR小鼠骨髓间充质干细胞分离及生物学特性的探讨
Ｏ ａｎｄ ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍＢＭ—ＭＳＣｓ ｏｆ
ＩＣＲ ｗａｓ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ．Ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ
１ｍｌ，
每隔３天，各消化３孔，用改良牛鲍计数板计数细胞，
１．ＩＣＲ小鼠ＢＭ—ＭＳＣｓ的形态学观察：分离的 ｍＢＭ—ＭＳＣｓ形态特点见图１。
图ｌ
ｍＢＭ—ＭＳＣｓ的分离和扩增培养
Ａ．培养４８ｈ后首次更换培养液，细胞已开始呈现短梭形、星形状，贴壁生长；Ｂ．细胞梭形化更加明显，并呈放射状排列的集落， 长短不一、粗细不均；Ｃ、Ｄ．继续培养细胞至８０％一９０％汇合，细胞多已为梭形、形态均一，并呈现漩涡状生长（Ｂａｒ：５０斗ｍ）
ｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｍＢＭ—ＭＳＣｓ）的细胞生物学特性。方法
取６—８周龄ＩＣＲ小鼠，利用全骨髓反复贴壁和有限稀释培养法分离
纯化ｍＢＭ—ＭＳＣｓ，观察形态特点，测定生长曲线和活力，利用流式细胞仪分析细胞的周期和鉴定表面抗原，诱导其向成骨、软骨 及脂肪细胞分化，采用染色法鉴定。结果新分离的ｍＢＭ—ＭＳＣｓ多呈小圆形，形态规整。培养传代后，细胞多变为梭形，大小 较均匀，形态较一致。随着传代的次数增加，细胞的生长曲线、活力及周期呈现快速发育期、平台期和缓慢期；流式结果细胞 ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＣＡ一１呈阳性反应，部分细胞ＣＤ９０、ＣＤｌ０５、ＳＴＲＯ一１呈阳性反应，ＣＤｌｌｂ和ＣＤ４５呈阴性反应；诱导分化为成骨细
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
小鼠骨髓间充质干细胞使用说明
小鼠骨髓间充质干细胞小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞组织来源：正常小鼠骨髓产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠骨髓间充质干细胞简介：小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。
本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
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小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
由于其来源充足，取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植领域得到了广泛的关注。
本实验旨在建立一种分离、培养、纯化及鉴定MSCs的方法，并对其生物学特性进行研究，为后续利用骨髓MSCs治疗肝脏疾病的研究提供稳定的干细胞模型。
1 材料与方法1.1 材料与试剂清洁级昆明小鼠，雌雄兼用，体重25±2g，购自吉林大学实验动物中心［合格证号：SCXK（吉）2003－0001］；DMEM 培养基（美国GibcoBRL公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；淋巴细胞分离液（上海恒信公司），0.25%胰蛋白酶（华美公司），兔抗鼠CD34、CD44荧光抗体（美国PHARMINGEN公司）。
1.2 方法1.2.1 骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15%FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1×106个／ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。
当细胞生长融合达80%－90%时，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜下控制消化时间，计数细胞，以1∶3密度扩增培养。
此时标记为P1代，以后每3－4d换液1次；当细胞生长融合达80%－90%时，继续以1∶3的密度传代扩增培养，传代培养并记为P2代，余类推。
倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。
1.2.2 骨髓MSCs生长曲线的绘制取对数生长期的P1、P2、P3代 MSCs以1.0×105／ml密度分别接种在96孔培养板中，每3孔为一组，每孔100μl。
分别在接种后的第1d、2d、3d、4d、5d、6d，以MTT法测细胞活力。
每孔加入MTT溶液（5g／l）10μl，混匀。
继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液。
每孔加入100μl DMSO溶液，振荡，镜下观察结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长处的光吸收值，每组取3孔测定值的平均值。
以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.2.3 骨髓MSCs的细胞周期分析取生长状态良好的P3代细胞，0.25%胰酶消化，制成单细胞悬液，采用流式细胞仪直接荧光法检测细胞周期。
其中激发光源为15mW氩离子激光，波长488nm。
FACS软件收集细胞，Lysis软件分析处理数据，记录阳性细胞百分率。
1.2.4 骨髓MSCs表面抗原检测取生长状态良好的 P3代小鼠骨髓 MSCs，用1：1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）混合液进行消化，离心后弃去培养基。
PBS洗涤后制成浓度为1×106／ml的单细胞悬液。
在3个管中各加100μl细胞悬液，并标记为1，2，3号。
在1、2号管中分别加入兔抗鼠 CD34-FITC 10μl，CD44-FITC 10μl，3管中加入抗人IG-FITC 10μl，3管为阴性对照。
室温孵育30min，流式细胞仪检测。
2 结果2.1 昆明小鼠骨髓MSCs的基本形态新分离的MSCs呈小圆形，形态规整。
MSCs传代培养的细胞大小均匀，形态较一致，多为梭形，此时细胞不再以成克隆的方式生长，而是散在分布生长。
MSCs 连续传3代，细胞形态无明显变化，无衰老征象，传代周期6－7d。
表明MSCs得到了进一步的纯化及扩增。
P3代后的MSCs能较好的用于后期实验。
2.2 骨髓MSCs生长曲线测定由MTT法测定小鼠P1、P2、P3代各个时间点骨髓MSCs活率，绘制的生长曲线呈S型（见图1），由图可见，MSCs在接种后第1－2d为潜伏期，随后便快速增殖，进入对数生长期，持续2－3d，此后细胞增长逐渐减缓，进入平台期。
P3代的MSCs能较好的用于后期实验。
2.3 骨髓MSCs细胞周期分析结果取生长良好的三代细胞，采用流式细胞仪直接荧光法，检测细胞周期，记录阳性细胞百分率，见图2。
由图可见，75.27%的细胞处于 G0－G1期，表明MSCs具有强大的分化增殖能力。
2.4 骨髓MSCs表面抗原的表达流式细胞仪检测显示P3代小鼠骨髓MSCs强表达CD44，表达率为88.71%，基本不表达造血细胞表面标志CD34。
（见图3）。
3 讨论骨髓MSCs是具有多向分化潜能和高度自我更新能力的组织干细胞。
研究证实骨髓MSCs不仅可以分化为与其组织来源一致的细胞，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能。
但骨髓中 MSCs的数量极少，仅占0.001%－0.01%［1］，要利用MSCs就必须对其进行体外分离、扩增。
现体外分离得到均一的骨髓MSCs的方法逐渐成熟，而通过体外扩增获得足够数量的间充质干细胞己实现。
分离骨髓MSCs的方法主要有四种：贴壁筛选法［2］、密度梯度离心法［3］、免疫磁珠分离法［4］、流式分选法［5］等。
后两种方法是目前获得MSCs纯度最高的方法，然而该方法操作复杂、费用及设备要求较高。
在分离中对细胞活性有一定影响。
图1 MSCs生长曲线图2 MSCs细胞周期图3 MSCs表面抗原的表达 A：CD34，B：CD44我们使用密度梯度离心和贴壁筛选相结合，利用Percoll（1.073g／ml）分离液将大部分造血细胞与单个核细胞分离开来，并经过体外贴壁培养一段时间，通过换液去除悬浮生长的造血细胞，获得较理想的骨髓MSCs。
我们用生长曲线来描述骨髓MSCs的生长繁殖能力，骨髓MSCs生长曲线分潜伏适应期、对数生长期和平台期。
发现昆明小鼠P1、P2、P3代骨髓MSCs的生长曲线均呈S型。
骨髓MSCs的生长性状稳定，P1、P2、P3代细胞的形态、生长曲线无明显差别，潜伏适应期1－2d，对数生长期2－3d，传代周期约6－7d。
MSCs具有无限增殖的能力，但前提是必须具备MSCs体外生长的最佳环境。
目前公认MSCs的培养必须用FBS做支持［6］，合适的血清浓度对细胞的生长具有关键性的作用。
血清中含有多种营养成分，对细胞的生长起着重要作用，但培养基中血清的浓度并非越高越好。