小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定王如岭;卫小凤;齐阔;王黎明;李莹;白仲添;严祥【摘要】Objective To develop a method of isolation and identification of exosomes of bone marrow mesenchymal stem cells.Methods The mesenchymal stem cells were cultured by whole bone marrow adherence method.A new reagent -exosomes extraction kit was used to isolate and collecte exosomes.The exosomes were identified by elec-tron microscopy,particle size detection,flow cytometry and Western blot.Results The expression of CD45 on the surface of the third generation bone marrow mesenchymal stem cells was negative,and CD73 and CD105 were posi-tive;exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells were round or oval,the size is non-uniform,the diameter is 30~100nm,have a complete membrane structure,and containing low-density substances;Particle size detection particle diameter of the main peak was 61.25 nm, in which the diameter of particles was about 20-200 nm accounted for 72.4%;exosome expressed CD63 and CD81;The expression of CD9 and CD63 from cell cul-ture supernatants was positive.Conclusions The exosomes can be collected in the medium of mesenchymal stem cells.The exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells can be identified by electron microscopy, particle size detection,flow cytometry and Western blot.%目的探讨骨髓间充质干细胞的外泌体的分离与鉴定方法.方法通过全骨髓贴壁法培养间充质干细胞;用新兴试剂法收集外泌体,采用电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot鉴定外泌体.结果第三代骨髓间充质干细胞表面CD45呈阴性表达,CD73和CD105呈阳性表达;骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构;粒径检测显示颗粒直径主峰为61.25 nm,直径为20~200 nm的颗粒占72.4%;外泌体CD63和CD81呈阳性表达;细胞培养上清液中可检测到外泌体CD9和CD63的蛋白表达.结论在培养间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过透射电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot 对骨髓间充质干细胞的外泌体进行鉴定.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)005【总页数】5页(P649-653)【关键词】间充质干细胞;外泌体;细胞分离;鉴定【作者】王如岭;卫小凤;齐阔;王黎明;李莹;白仲添;严祥【作者单位】兰州大学第一医院老年病科,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院普外二科,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省肝胆胰研究所,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院普外二科,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院甘肃省肝胆胰研究所,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院老年病科,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】R331外泌体(exosome)是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡[1]，广泛存在于人体大多数体液中如血液、尿液和唾液等[2]，其中包含有蛋白质、RNA、microRNA和DNA片段等[3]多种成分，参与人体许多重要的生理或病理过程，在细胞通讯、细胞迁移、免疫反应和肿瘤细胞增殖等方面起了重要的作用，影响疾病的发生发展[4]。

目前，外泌体的生物学研究受到极大关注，其相应的提取和鉴定方法是展开相关研究的重要前提。

本研究报道了骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)外泌体的一种分离和鉴定方法，为外泌体的深入研究提供实验基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.2 实验动物：SPF级BALB/C小鼠，雄性8 只，体质量20～30 g[中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，许可证号：SCXK(甘)2015- 0001]。

1.1.1 主要试剂：DMEM/ F1培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(Hyclone 公司)；双抗(青霉素及链霉素，Gibco公司)；PBS缓冲液、CD单克隆抗体(BD公司)；外泌体提取试剂盒(Invitrogeng公司)；细胞裂解、蛋白抽提试剂和ECL化学发光试剂盒(Thermo Fisher公司);兔抗鼠CD9、CD63单克隆抗体 (SBI公司)。

1.2 方法1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养：用全骨髓贴壁培养方法进行BMSCs 的培养。

细胞计数后调整为1×106个/mL后移入25 cm2培养瓶，放置于含5% CO2、37 ℃饱和湿度的细胞培养箱中孵育，72 h后全量换液。

此后每2～3 d更换培养液。

当原代细胞增殖汇合至80%左右时进行传代，以后每3～5 d传代1 次。

1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定：选择汇合度80%左右第3 代BMSC进行表面鉴定。

弃去培养瓶内培养基，加入0.25%胰蛋白酶进行消化离心，离心后的沉淀用1×PBS缓冲液清洗2 遍，进行细胞计数，调整细胞为1×106个/mL，并移入1.5 mL EP管中，每管分别加入CD73抗体、CD105抗体和CD45抗体，37 ℃避光，孵育30 min，再以1×PBS洗涤3 次，行流式细胞分析。

1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离：待细胞增殖状态良好后，血清改为无外泌体血清继续培养。

收集培养第3代间充质干细胞的培养上清液，经0.22 μm滤器过滤，再经超滤管浓缩。

然后按照提取试剂盒说明书加入相应比例的试剂和浓缩上清，混匀后4 ℃ 孵育过夜，4 ℃，10 000×g离心1 h，然后吸取上清，最后获得的沉淀为外泌体。

1.2.4 外泌体的鉴定1.2.4.1 电镜检测外泌体: 取分离纯化外泌体10 μL，加入等体积PBS 稀释后滴加于2 mm的载样铜网上，于室温静置1 min 后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3%(w/v) 磷钨酸钠溶液室温负染1 min，用双蒸水轻轻洗1 遍后室温晾干，于透射电子显微镜观察并照相。

1.2.4.2 Nano-ZS检测外泌体粒径: 将分离得到外泌体沉淀用1 mL经过滤的PBS混匀，然后缓慢注入仪器进行检测，并保存分析数据。

1.2.4.3 流式细胞仪检测外泌体标志物: 经抽提分离得到外泌体沉淀，用100 μL经过滤的PBS混匀，密封冰上保存，CD63和CD81两组抗体染色，标记为CD63和CD81；不染色的外泌体作为阴性对照，标记为阴性对照NC。

上机检测。

1.2.4.4 Western blot检测外泌体标志性蛋白: 收集分离得到的外泌体，细胞裂解和蛋白抽提试剂提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

配置 5%浓缩胶和 10%分离胶进行 SDS-PAGE电泳。

在 S1模式电压80 V和 S2模式120 V电压下分离，250 mA将凝胶上的蛋白湿转到PVDF膜上，2% BSA封闭液室温摇床摇动封闭 1h，加入兔抗鼠一抗(CD9 1∶1 000; CD63 1∶1 000; GAPDH 1∶1 000) 4 ℃孵育过夜。

TBST漂洗后加入羊抗鼠二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，再次TBST漂洗，ECL显色。

2 结果2.1 小鼠骨髓间充质干细胞表面分子的鉴定第3 代 BMSC:CD45呈阴性表达，CD73和 CD105呈阳性表达(图1)。

BMSC表面分子表达情况为∶CD45 0.8%、CD73 98.6%和CD105 95.9%。

2.2 透射电镜观察外泌体形态骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径约30～100 nm，有完整的膜结构，内含低密度物质(图2)。

图1 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞Fig 1 Flow cytometry profile of BMSCs 图2 电镜下的外泌体形态Fig 2 Transmission electron micrograph of exosome2.3 外泌体粒径分析外泌体平均粒径23.99 nm，粒径主峰61.25 nm。

粒子分布系数(polymer dispersity index，PDI)0.517 (图3)。

2.4 流式细胞仪检测外泌体表面标志物骨髓间充质干细胞的外泌体CD63和CD81呈阳性表达(图4)。

2.5 Western blot检测外泌体特异标志蛋白CD9和CD63提取的外泌体表达CD63和CD9蛋白(图5)。

3 讨论目前，外泌体的研究取得了很大的研究进展，但总体还是处于研究的初始阶段并且面临着很多的挑战[5]。

外泌体分离与鉴定的研究是该领域探索的重要基础。