乳酸菌冷冻保护剂配方设计
乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选
仪 器 设 备 :L J 1 冻 干燥 机 ,光 学 显 微 镜 G 一冷
( L MP S. O Y U)
于绝 大多数 细菌冷 冻 于燥 成 功 的关键 在 于有效 保 护 剂 的使用 ,保 护剂 呵以改变样 品冷冻干燥 时的物理 ,
摘要 :通过 单 因素 比较和正 交试验设计 ,确 定适合保加 利亚乳杆 菌和 嗜热链球 菌的最佳冻干保护 剂配
方 通过对 l种冻干保护剂单 因素保护 效果 的比较 ,以及 对选定的4 5 种保 护剂的正 交试 验结果 ,可 以
确 定嗜热链球 菌最佳 冻干保护 剂配方为脱脂乳粉 l%,海藻糖 l 2 %,甘 油3 %,谷氨 酸钠 l %,保加利亚
冻 十燥 过程会 造 成乳 酸菌 的细胞 膜 通透 性改 变 ,蛋
工 艺 技 市
11 试验材料与设备 .
试 验采用 的嗜 热链球 菌f.hr ohl s 1 S tem p i , .与保 t
白质 变性 失活 ,p H的动 态平衡 被破坏 ,D A 伤 和 N损
膜脂 肪 酸组 成发 生改 变 等l.在 发 酵剂 的 生产 过 程
梯度做3 个平行 ,将菌悬液均匀涂 升 .然后将平板移 人
培养 '
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存靴) 活 =
2 结 果 与讨 论
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方 差分析结 果表明 :不同保护剂 对嗜热链 球菌冻
干存活率 影响的 著性 概率 值 P 000 0 5 = . < . ,这 说明 0 0
M1培养基 :用 于嗜热链 球菌 的增 殖培 养 :MR 7 S
瑞士乳杆菌冻干发酵剂制备中保护剂的选择
１ １ １ 菌种 ．．
瑞 士乳 杆 菌 ６ ２ （ ａｔｂ ｃ ｌｓ ｅ— ０ ４ Ｌ ｃ ａ ｉ ｕ Ｚ ｏ ｌ ｈ
ｖｔ ｕ ： ｅ ｃ ｍ） 购于 国 内贸 易 部 食 品 发 酵 研 究 所 菌 种 保 ｉ
Ｏ 前 言
乳酸菌 冻干 发 酵剂 已广 泛 应 用 于食 品 、 造 等 酿 行业 ， 不仅提 高 了产 品品质 ， 障了消 费者 的利益 它 保 和健康 ， 且使 用 起 来更 加 方 便 。如 何 更 好地 将 生 而
产 中选育 到 的优 良乳 酸 菌保 存 下 来 ， 择 合适 的保 选
瑞 士乳 杆 茵 的保 护 效 果 。 实验 表 明 ， 用 １ ％ ～ １ ％ 脱 脂 奶 ，０ ～ １ ％ 海 藻糖 作 为 保 护 剂 ， 瑞 士 乳 杆 茵 的 选 ０ ５ １％ ５ 对
冻 干保 藏 有较 好 的保 护 效 果 。 关 键 词 ： 士乳 杆 茵 ；冷 冻 干 燥 ； 护 剂 瑞 保 中图 分 类 号 ： Ｓ ２ ２ ３ Ｔ ０ ． 文 献 标识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ７ ８ ８ ２ ０ ） ３—０ ２ １ ０ —０ １ （ ０ ６ ０ ０ ０—０ ３
（ ｏｌ ｅｏ Ｃ ｅ ｓ ｙａ ｄ Ｌ ｆ Ｓ ｉ ｃ ， ｒｅＧ ｒｅ ｉｅｓ ｙ Ｙｉ ａ ｇ ４ ３ ０ ， ｈｎ ） Ｃ ｌ ｇ ｆ ｈ ｍｉ ｒ ｎ ｉ ｃ ｎ ｅ Ｔｈｅ ｏ ｇ ｓ ｅ ｔ ｅ ｅ Ｕｎｖ ｒ ｔ ， ｃ ｎ ４ ０ Ｃ ｉ ｉ ｈ １ ａ
１ １ ２ ＭＲ ． ． Ｓ培养 基
蛋 白胨 １ ， 肉膏 １ ， ０ｇ 牛 ０ｇ 酵
母 膏 ５ｇ 磷酸 氢二 钾 ２ｇ 柠 檬酸 三铵 ２ｇ 乙酸钠 ５ ， ， ，
细菌冻干保护剂配方
细菌冻干保护剂配方
细菌冻干是一种常见的保存细菌的方法，但在冻干过程中，细菌容易受到氧化、脱水等因素的影响，从而导致细菌数量减少或丧失活性。
为了提高细菌冻干的保护效果，可以添加一些保护剂来保护细菌。
下面是一种常用的细菌冻干保护剂配方：
成分：
1. 磷酸二氢钾 0.1mol/L
2. 葡萄糖 5% (w/v)
3. 甘油 10% (v/v)
4. 酪蛋白酸钠 0.5% (w/v)
5. 硫酸镁 0.01mol/L
6. NaCl 0.9% (w/v)
制作方法：
1. 在一烧杯中加入适量的去离子水，加热至85℃左右。
2. 待水温降至60℃左右时，加入磷酸二氢钾和葡萄糖，充分溶解。
3. 加入甘油和酪蛋白酸钠，充分混合。
4. 最后加入硫酸镁和NaCl，搅拌均匀。
5. 调节pH值至7.0左右，再过滤灭菌即可。
使用方法：
将细菌培养至对数生长期，加入预先配制好的保护剂，混匀后放入冻干机中进行冻干处理。
细菌冻干保护剂配方中的甘油和葡萄糖可以提供必要的营养物质和保护剂，酪蛋白酸钠可以保持细菌的活性，硫酸镁和NaCl则可以调节渗透压和维持细胞的完整性，从而提高细菌的存活率和保护效果。
发酵乳杆菌(H0801)冻干保护剂的优化
分析与检测发酵乳杆菌是乳酸菌的一种，广泛存在于发酵食品中，由于其对胃肠道环境具有较好的适应能力、对胆固醇具有较强的降解能力以及具有免疫调节等促进人体健康的作用。
本研究以发酵乳杆菌为研究对象，对其冻干保护剂种类及添加量进行筛选，利用单因素和正交实验确定其冻干保护剂的最佳配方。
1 材料1.1 菌株发酵乳杆菌（H0801），由汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司提供。
1.2 MRS培养基蛋白胨1%、牛肉粉0.5%、酵母粉0.4%、葡萄糖2%、吐温-800.1%、磷酸二氢钾0.2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸猛0.005%以及琼脂粉1.5%，按比例配制1 L，pH为6.80。
1.3 菌泥制备5%接种量、温度37 ℃、培养24 h，12 000 r/min离心10 min，菌泥备用。
2 方法2.1 单一保护剂添加量的确定5种保护剂原料及其添加量为脱脂乳粉（4%、6%、8%、10%与12%）、海藻糖（1%、3%、5%、10%与15%）、麦芽糊精（0.5%、1%、3%、5%与7%）、VC钠（0.02%、0.04%、0.08%、0.1%与0.15%）及甘油（0.1%、0.5%、1%、1.5%与2%）。
分别用5种不同浓度保护剂与菌泥混合，菌泥与保护剂比例为1∶2，混合均匀后，分装到冻干机托盘中，进行冻干，测定冻干前后的活菌数，并计算冻干存活率。
2.2 不同组合保护剂添加量的确定根据单一保护剂实验结果，制定4个不同添加量的组合保护剂配方，分别配置冻干保护剂，在相同的冷冻干燥条件下冻干，并测定每个方案冻干前后的活菌数，计算存活率。
①海藻糖15%、脱脂乳粉12%、VC钠0.15%、甘油0.1%与麦芽糊精1%；②海藻糖5%、脱脂乳粉6%、VC钠0.08%、甘油0.5%与麦芽糊精3%；③海藻糖10%、脱脂乳粉8%、VC钠0.1%、甘油1%与麦芽糊精5%；④海藻糖3%、脱脂乳粉10%、VC钠0.04%、甘油1.5%与麦芽糊精7%。
瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择
瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择吴玲;潘道东;刘海燕【摘要】研究几种高、低分子化合物对冻干瑞士乳杆菌的保护作用.以冻干后的活菌存活率和凝乳时间为考察指标,先进行单因素试验筛选出保护效果最好的4种物质甘油、葡萄糖、组氨酸和牛血清白蛋白,用这4种物质复配,进行复合保护剂正交试验.结果表明:将增菌培养基发酵液(含10%脱脂乳)与冻干保护剂溶液混合冻干,最佳保护剂配方为0.5%甘油+15.0%葡萄糖+150 mg/L组氨酸+1.5%牛血清白蛋白.加入冻干保护剂后,瑞士乳杆菌冻干后存活率可达89%.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)001【总页数】4页(P157-159,163)【关键词】瑞士乳杆菌;冷冻干燥;保护剂【作者】吴玲;潘道东;刘海燕【作者单位】常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系,江苏,常州,213164;南京师范大学国家乳品加工技术研发分中心,江苏,南京,210097;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江,宁波315211;山西大同大学农学院,山西,大同,037009【正文语种】中文瑞士乳杆菌是一种具有保健功效的新型酸奶生产菌种，蛋白酶活力较高，其在水解乳蛋白过程中产生的活性肽可以抑制血管紧张素转化酶Ⅰ（ACE）的活性，从而产生降血压的功效［1］。
目前，瑞士乳杆菌制品主要是通过冻干的形式生产的，冷冻干燥过程会对菌体细胞造成一定的伤害甚至使菌体死亡，主要有冷冻伤害和冻干伤害，降低了菌种的存活率，对生产十分不利。
在实际生产中通常采用各种保护剂来降低冻干过程对乳酸菌的伤害。
一些亲水且能透过细胞膜的小分子保护剂能渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，冷冻时可减少对细胞的损伤；而不能穿透细胞膜的大分子保护剂有很强的亲水特性和氢键形成能力。
保护剂利用它们的氢键和亲水基形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，保护了细胞结构［2］。
中国关于瑞士乳杆菌冻干保护剂的研究较少，且常用保护剂都比较单一，保护效果有限。
酸奶菌种冷冻干燥保护剂的筛选研究_黄丽金
酸奶菌种冷冻干燥保护剂的筛选研究黄丽金，陆兆新＊，袁勇军（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 ２１００９５）摘 要：本研究采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计法，对蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇、可溶性淀粉、明胶、抗坏血酸、谷氨酸钠、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐以及脱脂奶粉等１４种材料对德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种冷冻干燥的保护效果进行评价。
结果表明：对德氏乳杆菌保加利亚亚种在冷冻干燥中有显著保护作用的是蔗糖、甘油、山梨醇以及脱脂奶粉；而唾液链球菌嗜热亚种有效的冷冻干燥保护剂为甘油、谷氨酸钠和脱脂奶粉。
关键词：德氏乳杆菌保加利亚亚种；唾液链球菌嗜热亚种；Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ设计法；冷冻干燥；保护剂Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒ Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ ｆｏｒ Ｙｏｇｈｕｒｔ ＳｔａｒｔｅｒＨＵＡＮＧ Ｌｉ－ｊｉｎ，ＬＵ Ｚｈａｏ－ｘｉｎ＊，ＹＵＡＮ Ｙｏｎｇ－ｊｕｎ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ， ｍａｌｔｏｓｅ， ｌａｃｔｏｓｅ， ｆｒｕｃｔｏｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ， ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ｍａｎｍｔｏｌ， ｓｏｒｂｉｔｏｌ， ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ， ｇｅｌａｔｉｎ， ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ， ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ， Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｓｋｉｍｍｉｌｋ ｆｏｒ ｙｏｇｈｕｒｔ ｓｔａｒｔｅｒ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｃｒｏｓｅ， ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ｓｏｒｂｉｔｏｌ ａｎｄ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓｆｏｒ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ， ｗｈｉｌｅ ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｔｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｔｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ； Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ；ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ；ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００５）１２－０１０３－０４收稿日期：２００４－１０－１０ ＊通讯作者作者简介：黄丽金（１９８０－），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物及其生物技术。
混合乳酸菌复合冻干保护剂的研究
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｏ ｆ ｔ ｈｅ Ｃｒ ｙ ｏ ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ａ ｎ ｔ ｆ ｏ ｒ Ｃｏ ｍ ｐｏ ｓ ｉ ｔ ｅ ｄ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ
Ｃ ＨＥ Ｎ Ｈ ｅ － ｊ ｉ ａ ， ＭＵ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ — ｑ ｉ ｎ ｇ
点【 ｌ Ｊ 。通过真空冷冻 干燥 原理分析 ， 其干燥过程会造成 乳酸菌 的损伤圜 。研究 表明 ， 添加保护剂可 以改变冷冻 干燥 时菌 体细 胞所 处 的物理 、 化 学环 境 ， 减 轻或 防止 冷冻 干燥 对菌体 细胞 的损 害 ， 使乳 酸菌保 持原 有 的理 化特性 和生物 活性 ， 因此 保护剂 有效利用 已成 为提 高 菌种存活率 的关键 技术 ［ ３ １ 。 本研究将嗜热链球菌 、 保加 利亚乳杆菌 、 嗜 酸乳杆 菌按 ３： ２ ： １ 比例 ＿ ４ １ 混合 ， 进行乳
合乳酸 茵最佳保护 剂配方为 ： 甘氨酸 １ ． ０％， 脱脂乳 １ ０ ． ０％， 海藻糖 ７ ． ０％， 山梨醇 １ ． ０ ％。 研 究表 明 ， 冻干乳 酸茵发 酵
剂发酵酸度、 产 香 及 产 黏 特 性 良好 ， 且冷 冻 干燥 法制 备 的复 合 冻 干保 护 剂 对 菌种 保 护 效 果优 于 单一 保 护 剂 。 关键词 ： 冷 冻 干燥 ； 乳酸菌 ； 保 护 剂
嗜热链 球 菌 （ Ｓ ｔ ｒ ｅ ｐ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｓ ， Ｓ ． ｔ ） 来自 西藏 雪莲 ， 高产 胞外 多糖 ， 由内蒙古农 业 大学 乳酸 菌
２ ０ １ ３年 ９月
第３ ４卷第 １ ８期
混合乳酸菌复合冻干保护剂的研究
陈贺佳 ， 牟光庆’
乳酸杆菌培养
培养基配方如下"改良MRS培养基蛋白陈10g牛肉膏10g酵母提取物5g葡萄糖20个吐温80 1 g琼脂粉15g乙酸钠5g柠檬酸二铰2gK2HPO4 2g MgSO4.7H2O0 0.58g MnSO4.4HZO 0.25g碳酸钙20g蒸馏水1000 mL pH6.2 121 C x l0 min灭菌MRS培养基蛋白陈109牛肉膏109酵母提取物5g葡萄糖209吐温8019琼脂粉159乙酸钠5g柠檬酸二按2gKZHPO429MgSO4#7HzO0.589MnSO4#4HZO0.259蒸馏水1000mLpH6.212loCxlsmin灭菌明胶基础培养基蛋白陈lg酵母提取物lg葡萄糖0.19明胶129盐溶液4mL蒸馏水100mLpH值7.0115oCxlsmin灭菌蛋白陈水培养基蛋白陈109NaC巧g蒸馏水IO00mLpH值7.012loCX15mill灭菌冻干保护剂脱脂乳粉1209蒸馏水gsomL115oCxlsmin灭菌2.3.1.1酸菜中乳杆菌的分离与纯化取酸菜汁lmL,用无菌PBs缓冲液梯度稀释到10-,,分别从10一!10石!10一,三个稀释度的试管中各取0.2mL涂布于改良MRS琼脂培养基上,于37e!80%氮气!10%氢气和10%二氧化碳的厌氧环境下培养2小48小时后,挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落,进行革兰氏染色!镜检"凡是革兰氏阳性的菌株,继续在MRS培养基上纯化培养,直至镜检为纯菌"2.3.1.3过氧化氢酶试验挑取固体培养基上培养24小时后的单个菌落,置于洁净玻片上,滴加3%过氧化氢溶液数滴(新鲜配制),在305内有大量气泡产生者为阳性(+),不产生气泡者为阴性(一)"其中过氧化氢酶试验阴性的杆菌初步确定为乳杆菌(敖敦格日勒等,2002)"将这些菌株编号后接种到MRS斜面培养基上,培养24小时后置4e冰箱中保存备用"2.3.1.4菌种保存将己经分纯的乳杆菌接入10mL液体MRS培养基中37e培养20小时后,离心(6000甲m离心10min)收集菌体,然后加入3mL冻干保护剂,对菌体进行悬浮,混匀后取分装至安瓶瓶中(600林F瓶),然后放入一20e的冰箱中预冻12小时"预冻结束后,立即放入冻干机中进行冷冻干燥,搁板温度均为一40干燥压力均为10Pa,干燥温度均为202.3.2.5部分分离株的糖发酵试验将分离自酸菜样品的分离株Ll一L10和分离自猪肠道样品的分离株L10一L20在MRS固体培养基上划线,37e恒温培养24h后,挑取单个菌落接入发酵管内,放入灭菌试管中,37e培养一周后观察试验结果,并记录,阳性用(十)表示,阴性用(一)表示"通过菌种对单糖!二糖!多糖以及糖普和糖醇类等碳水化合物的利用情况加以鉴定它们的种"其反应结果仅局限于保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌生产的普通酸奶, ,嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵乳糖产生乳酸、醋酸、细菌素等健康促进成分,但是它们对酸及胆汁盐非常敏感，难以通过胃肠环境而在肠道中定植。
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AlBlCl AlB2C2 AlB3C3 A2B2C3 A2B3C1 A2B1C2 A3B3C2 A3BlC3 A3B2C1
95．00±1．6971a 52．12±2．9698c 61．82±1．5556b 36．36±2．2627f 23．03±2．4042h 48．48±1．9799d 25．00±1．8385g 24．24±1．9799g 46．06±1．5556e
实验方法是将乳酸菌培养液 40ml 离心后的
—32—
沉淀物 (保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌比例 1：1) 用 10ml 生理盐水完全溶解，在旋涡混合器上将此 溶液混合均匀， 每个样品取 3ml 此溶液与等体积 的不同的保护剂溶液混合， 在-80°C 冰箱中冷冻 24h， 在 自 然 条 件 下 使 样 品 解 冻 ， 分 别 测 定 冷 冻 前 和冷冻后每 m1 溶液中的菌体数目， 最终得到冷 冻存活率，从而选取保护效果好的保护剂，包括保 护剂的浓度。
1.2.1 正 交 实 验 这 部 分 要 列 出 因 素 水 平 表，格式如下表为准：
表 1 保护剂正交设计表
序号
1
2
3
4
Байду номын сангаас
名称
蔗糖 A 空列 D 脱脂奶 B 谷氨酸钠 C
水平 1 % 10.0
10.0
5.0
水平 2 % 12.5
5.0
7.5
水平 3 % 15.0
7.5
10.0
1．2.2 测定方法 冷 冻 存 活 率％=(冷 冻 后 溶 液 中 的 活 菌 数 ／ 冷
有 报 道 称 [2]如 果 将 乳 酸 菌 培 养 液 直 接 进 行 冷 冻干燥，其存活率仅有 10%~30%左右。 但是干燥 过程对乳酸菌的损伤程度比较小， 冷冻是引起乳
酸菌死亡的主要环节。 菌体冷冻干燥的存活率受 多方面的影响，包括起始的细胞菌液浓度，保护介 质和再水合条件[3]，其中保护介质的添加是一个重 要环节。 一种保护效果好的保护剂要求在冷冻干 燥过程中可以提供保护作用， 并且有良好的自身 稳定性和有利于再水合， 还可以方便有效除去冻 干材料中的多余溶剂。 关于保护剂的报道也有很 多，比较常用的有蔗糖、乳糖、脱脂乳和谷氨酸钠， 但大多是针对单菌种的， 对混菌的保护剂研究较 少。另有国外文献报道[4]浓度为 1%~68％的蔗糖溶 液可作为冷冻保护剂， 它可以用于杆菌和球菌的 保护剂，原因是蔗糖可以抑制表面自由基的产生， 对菌体细胞有较好的保护作用。 在-20°C~-70°C 保存发酵剂时， 乳糖浓度在 1%~10%的溶液比甘
冻前溶液中的活菌数)×100
2 结果与分析
单因素保护剂实验结果见表 2。 表 2 保护剂单因素实验结果(n=2)
保护剂
5％蔗 糖 10%蔗 糖 15％蔗 糖 5％脱 脂 乳 10%脱 脂 乳 15％脱 脂 乳
混菌冷冻存 活率
保护剂
混菌冷冻存 活翠
55±2．8284bc 5％谷氨酸钠 64±5．6569a
乳浓度为 10％，谷氨酸钠浓度为 5％，冷冻后菌体 细胞的混菌冷冻存活率可达到 95．00％，用显微镜 观察杆菌球菌比例维持在 1：1~1：1．5， 比例与原 样中杆菌和球菌的比例略有升高， 这主要是由于 保加利亚乳杆菌是对冷冻干燥敏感的菌种， 而嗜 热链球菌对冷冻的敏感程度相对较低。冷冻时，培 养液中杆菌的死亡率比球菌高。
实验中选取了对两种单菌 (保加利亚乳杆菌 和嗜热链球菌)都有冷冻保护效果的蔗糖、乳糖、 脱脂乳和谷氨酸钠来进行实验。 有报道称影响菌 体存活率的主要因素是冷冻速率。在缓慢冷冻时， 胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增 高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死 亡。 如果快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外 渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原 生质膜的损伤也较小， 菌株不易死亡， 影响也较 小。 如在-79℃、-196°C 冻结时菌体细胞的存活率 高达 90%以上。 刘振民，骆承庠研究发现[6]，在冷 冻 过 程 中 存 在 两 个 冰 晶 生 成 带 ， 即 0°C~-3.7°C 和-30°C~-37.4°C。 快速通过冰晶生成带可以减小 菌体的冷冻损伤。为了满足上述条件，可以在超低 温冰箱中冷冻样品，温度设定为-80℃。 对照组(不 添加保护剂)存活率为 12％，冷冻存活率低的原因 是这个过程使较敏感的蛋白质变性， 降低了细胞 活 性 [5]。
第 40 卷第 3 期 2011 年 7 月
发酵科技通讯
乳酸菌冷冻保护剂配方设计
杜磊 1 乔发东 2 (1.安阳工学院生物与食品工程学院 河南安阳 455000;
2．河南工业大学生物工程学院 河南郑州 450000)
摘 要：乳酸菌浓缩发酵剂的制备过程中，冷冻对菌体的损伤比较明显。 通过在保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌混菌菌悬液中添加不同的保护剂并测定冷冻前后乳酸菌菌数， 筛选出适用的保加利亚乳杆 菌和嗜热链球菌混菌的保护剂。最终确定的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌保护剂配方为：蔗糖浓度 为 10％，脱脂乳浓度为 10％，谷氨酸钠浓度为 5％。 菌体经冷冻处理后，冷冻存活率可达到 95．0％，比不添 加保护剂的菌体存活率大大提高。 此配方也简单易得，完全可以满足生产需要。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 1，1．1 MRS 固 体 培 养 基 ： 蛋 白 胨 1％， 牛 肉 膏 1％，酵母膏 0．5％，葡萄糖 2％，吐温 80 ml，磷酸二 氢钾 0．2％，醋酸钠 0．2％，柠檬酸三铵 0.2％，硫酸 镁 0.02％，硫酸锰 0.05％，琼脂 1．5％。 1．1．2 脱脂乳粉由圣元乳业有限公司生产。 1．1．3 氯化钠、乳糖、蔗糖、谷氨酸钠均为生化级。 1．1．4 玻璃仪器：试管，移液管，平板，安瓿瓶等。 1．1.5 净化工作台 SW—VJ—1FD。 1．1．6 小型旋涡混合器。 1．1．7 高压灭菌器 HVE—50(日本 HIRAYAMA)。 1．1.8 显微镜 NIKON 50i。 1．1．9 超低温冰箱 DW—HL218(中科美菱)。 1．1．10 恒温培养箱 SKG02．420(黄石市恒丰医疗 器械有限公司)。 1．1．11 超纯水机 KL—UP—III—10 (台湾艾柯)。 1．2 试验条件
60±4．2426ab 10％谷氨酸钠 58±2．8284abc
62±4．2426ab 15％谷氨酸钠 45±2．8284d
36±2.8284e
5％乳 糖
45±4．2426d
51±2.8284cb 10％乳糖 50±1．4142cd
58±4．2426abc 15％乳糖 55±2.8284bc
表 2 中的数据可以看出， 蔗糖浓度为 10％、 15％的 溶 液 ，脱 脂 乳 浓 度 10％、15％的 溶 液 ，谷 氨 酸钠浓度为 5％、10％的溶液， 乳糖浓度为 10％、 15％的溶液菌体细胞存活率比较高， 结果与吕加 平，骆承庠的研究结果相似。 在单因素的条件下， 最好的保护剂是浓度为 5％谷氨酸钠溶液， 其保 护效果可以达到 64％。 考虑到乳糖和蔗糖同属于 糖类，其保护机理应当相似，而蔗糖与乳糖在浓度 一样的情况下， 蔗糖溶液的保护效果比乳糖溶液 的保护效果明显更好，且蔗糖易得到，而乳糖的成
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发酵科技通讯
第 40 卷
油有良好的保护性。 浓度为 1%~10%的脱脂乳溶 液也可作为乳酸菌的冷冻保护剂。 脱脂乳可以成 为 保 护 剂 的 原 因 是[5]:提 高 了 细 胞 的 稳 定 性 以 降 低 细胞损伤；创造了一个多孔的环境有利于再水合； 含有大量的蛋白质给细胞提供了保护性的外衣。
第 40 卷第 3 期 2011 年 7 月
发酵科技通讯
本也较高，所以选择蔗糖进行正交实验。 以上物质可能有协同的保护作用， 所以设计
了 4 因素 3 水平的正交试验。 正交设计表见表 1。 正交设计后的冷冻存活率的试验结果见表 3。 表 3 保护剂正交试验结果（n=2）
试验序号
混菌冷冻存活率 ％
Key words：Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, freeze protective agent
在乳酸菌浓缩发酵剂的制作过程中， 由于冷 冻时对乳酸菌的破坏较大， 所以冷冻保护剂的选 择一直是浓缩发酵剂制备中的一个关键。
Kilara[1]认为当初始细菌浓度 越 大 时 ，冷 冻 干 燥获得较高存活率的几率就越大， 这主要是通过 降低了单个菌体细胞暴露在介质中的面积来达到 保护的效果。 在实际生产中尽量通过提高初始细 菌浓度来提高菌体的冷冻干燥时的存活率， 从而 减小菌体的死亡和损失。 这也正是以上培养和离 心过程中要求单位体积的培养基中菌体数目 (细 菌浓度)的原因。
对表 3 中的数据进行正交方差分析， 各列的 级 差 分 别 为 ：37．88、18．99、19．29、13．89，空 列(第 2 列)的级差并没有比其它列的级差都大，所以这三 种物质协同作用不明显， 不同物质溶液的保护效 果为蔗糖溶液>脱脂乳溶液>谷氨酸钠溶液，相同 的溶液不同浓度之间保护效果蔗糖：10％>12．5％> 15％； 脱 脂 乳 ：10％>5％>7．5％； 谷 氨 酸 钠 ：5％> 7．5％>10％。 同时还发现有些试验结果反映，由 3 种不同物质组成的保护剂的保护效果还不如单因 素的保护效果好， 这可能是由于保护剂的配比不 合理所致，但效果都比对照组(不添加保护剂)好。 效果最好的保护剂配方是蔗糖浓度为 10％，脱脂
3 结论
用此配方制备的保护剂对保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌混菌保护效果良好，并且方便易得，在 工业化生产乳酸菌浓缩发酵剂时也可使用。
参考文献：
[1]Kilara， A， Shahani， K.M． and Das． N． K. Effect Of cryoprotective agents On freeze -drying and strorage Of lactic culture． Cult．Dairy Prod·，1976，(11)：8 [2]徐 成 勇 ，郭 本 恒 ，吴 昊 等．酸 奶 发 酵 剂 和 乳 酸 菌 生 物 技 术 育 种 ．中 国 生 物 工 程 杂 志 ，2004，24(7)：55—59 [3] E.costa， J usall． N． teixido， N· Garcia and I． vinas． Effect of protective agents，rehydration media an initial cell concentration on viability of pantoea agglomerants strain CPA -2 subjected to freeze-drying．Journal of applied microbiology，2000， (89)：793～800 [4]Zdenek hubalek．Protectant sused in the cryopreservation of microorganisms．Science direct， 2003，(46)：205-229