第二章细胞生物学研究方法 细胞生物学(王金发版)章节总结
细胞生物学 第二章细胞生物学研究方法
§1 细胞形态结构的观察方法
三、扫描隧道显微镜 （Scanning tunneling microscope，STM）
• 于1981年发明，发明者获 1986年度诺贝尔物理学奖。
• 特点： ①具有原子尺度的高分辨力，
侧（横）分辨率为0.1-0.2nm， 纵分辨率0.001nm； ②除在真空外，还可在空气、 液体等条件下观察； ③非破坏性测量：不受电子 束的轰击、破坏。
• 因此，可用已知的抗体检测未知的抗原。
• 但多数抗原-抗体结合后不出现可见反应，即不能检测 到二者的这种特异性结合。如何检测抗原-抗体发生了 结合反应？
• 用一种可见的标记物标记抗体，通过检测标记物的存
在与否判断抗原-抗体是否发生了结合反应——免疫标
记技术。
抗原
标记物
抗体
二、特异蛋白抗原的定位与定性
s 将二次电子收集并经一系列 的处理在荧光屏上成像。
s 这样，可以得到样品表面的 立体图像。
二、电子显微镜
• 扫描电镜的样品制备：
s 取材； s 固定； s 脱水； s 临界点干燥； s 喷镀； s 电镜观察。
• 分辨本领：较低，一般 在3nm。
• 放大倍数：几万倍。
二、电子显微镜
• 特点：成像具有立体 感。
• 可见光的波长400700nm。
• 光学显微镜的最大分辨 率为0.2μm。
一、光学显微镜
• 光镜样品制备： 石蜡包埋切片， 苏木精-伊红染色。
一、光学显微镜
（二）相差显微镜和微分 干涉显微镜
• 原理：利用显微镜中的 特殊装置，使光线通过 样品时波长和振幅发生 变化，以增大样品明暗 的反差。
• 用途：这两种显微镜可 用于观察未染色的活细 胞的细胞结构及其动态 变化。
细胞生物学 第2章 细胞生物学研究方法
PRA在散发性浸润性乳腺导管癌中 的表达
王辛，赵彤，赵嘉佳，熊静波. 中华医学杂志 2010， 90（20）：1399-1402
（三）原位杂交技术
• 自学
三、 细胞分离技术
（一）离心分离技术
用离心力和沉降系数的差异进行分离、浓缩和提纯的方法。 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基
描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。
Scanning electron microscope（ SEM）
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面
激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，
次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电
子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 用于观察活细胞等无色透明标 本 • 聚光镜中央有挡光片，照明光
线不直接进人物镜，只允许被
标本反射和衍射的光线进入物 镜，因而视野的背景是黑的， 物体的边缘是亮的。 • 可观察 4~200nm的微粒子，
分辨率比普通显微镜高50倍。
（五）相差显微镜
• dX/dt=[2r2 (ρp—ρM) /9η]· · g=s g
• 式中dX/dt为粒子的沉降速度，ρp:颗粒的密度；ρM：悬浮 介质的密度；η：介质粘度；r：为粒子的半径；g：为重 力加速度。 • S：沉降系数（sendimetation coefficient）， 与颗粒直 径、颗粒密度、介质密度、介质粘度有关； • S的单位：秒; • 习惯上把10-13s作为沉降系数的单位（svedberg unit）， 简称S（大写）
λ=光源波长，可见光0.5um N=介质折射率,空气为1,油为1.5 θ=物镜镜口张角的半角
细胞生物学研究方法部分总结
细胞生物学研究方法部分总结细胞生物学研究方法部分总结合肥学院202*届《细胞生物学》阶段性总结题目第三章细胞生物学研究方法部分总结姓名：崔俏俏专业：生物工程班级：12级生物工程（1）班学号：1202X1*027指导教师：李老师202*年10月22日第三章细胞生物学研究方法学习细胞生物学研究方法，了解实验原理，掌握基本实验方法，对于学习细胞生物学基础知识，加深对理论学说的理解，以及进行创新性研究，推动本学科和相关学科的不断发展都具有重要的意义。
细胞生物学的研究方法和实验技术很多，根据研究方法的性质、特点、应用范畴和实验技术原理、类型及条件的相关性和类同性，可以将其主要的研究方法和实验技术分为以生物有机体组织细胞结构自然状态为主体的形态学研究方法、细胞化学研究方法和模拟体内环境、以实验性设计为特色的综合性研究方法和分子生物学技术等。
第一节细胞形态结构的观察方法光学显微技术根据光学原理不同，目前光学显微镜已发展成多种类型，教学研究领域中常见的主要有以下几种：一．暗视野显微镜暗视野显微镜又称超显微镜或限外显微镜。
它是根据“丁达尔效应”光学原理，设计出来的一种特殊显微镜，比普通光学显微镜的分辨率高50倍。
它通过暗视野聚光器，把直射光照明变为斜射光照明，使通过样品进入物镜成像的光只有衍射光。
所以，整个观察视野背景是黑暗的，而观察的样品在黑暗的背景反衬下显示出清晰的衍射光结构轮廓。
二．相差显微镜相差显微镜能够把相差变成振幅差，主要依赖于它的特殊结构。
首先用环状光阑代替可变光阑，环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的，其作用是将直射光所成的像从一些衍射旁缘分出来。
其次是用带相板的相差物镜代替普通物镜，相板分为共轭区和补偿区，可选择性地镀上吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，从而使相板具有既能推迟直射光线或衍射光的相位，又有吸收光调整亮度、突出叠加效果的作用。
三．荧光显微镜荧光显微镜是能够利用细胞内某些化学成分或细胞经特殊染色后，受到特定波长的光激发后，产生特征性波长的荧光，来检测细胞内某些化学组成的一种仪器。
二章节细胞生物学研究方法
• 免疫细胞化学技术(immunocytochemistry) 利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分
布的一类技术。主要分为两大类: 免疫荧光 技术和免疫电镜技术。
分离技术
• 分离技术是一大类技术的总称，包括细胞 组分的分离和生物大分子的分离
第二章.细胞生物学研究方法
• 显微成像技术 • 细胞化学技术(cytochemistry) • 细胞培养和细胞融合 • 分离技术 • 分子生物学方法
显微成像技术 • 光学和电子显微镜成像原理 三个基本要素:①照明系统， ②被观察的样品，
③聚焦和成像的透镜系统
• 常用的光学显微镜 • 普通双筒显微镜(binocular microscope) • 荧光显微镜(fluorescence microscope) • 相差显微镜(phase contrast microscope) • 暗视野显微镜(dark field microscope) • 倒置显微镜
(gene knockin) • 乳腺生物反应器技术
基因克隆(gene cloning)
• 这项技术可概括为∶ 分、切、连、转、选
PCR技术
• PCR是英文聚合 酶链式反应 (polymerase chain reaction) 的简称， 是80年代发展起 来的一项具有重 大意义的分子生 物学技术
细胞融合与单克隆抗体技术
• 细胞融合(cell fusion) 指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或
原生质体融合形成一个杂种细胞(图2-33)。 • 单克隆抗体技术(monoclonal antibody
technique) 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆
02细胞生物学第二章 细胞生物学研究方法
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
• 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直 接进人物镜，只允许被标本反射和衍 射 的光线进入物镜，因而视野的背景 是黑 的，物体的边缘是亮的。
• 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率 比普通显微镜高50倍。
（五）相差显微镜
• 相差显微镜在结构上进行了特别设计，尤其是光学系统有很 大的不同， 可用于观察未染色的活细胞 .由P.ZEMIKE于1932年 发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖.
透射电镜
—、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 •1. 构成： • ①照明系统 • ②光学放大系统 • ③机械装置 •2. 原理：经物镜形成倒 立实像，经目镜进一步 放大成像。
透镜的像差 •球面像差 •慧形像差 •像散 •像场弯曲 •畸变 •色差
球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系 列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于 主轴上的同一位置， 以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散 光斑（俗称模糊圈），则此光 学系统的成像误差称为球差。
A Yeast Cell
冰冻断裂与 冰冻蚀刻技术
（二）扫描电子显微镜
•20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。
• 分辨力为6~10nm ，由于人眼的分辨力 （区别荧光屏上距离 最近两个光点的能力 ）为0.2mm，扫描电 镜的有效放大倍率为 0.2mm/10nm=2000 0X。
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样 品，在样品表面激发出次级电子，次级电子 的多少与样品表面结构有关，次级电子由探 测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电 子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图 像。
• 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内 的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
王金发细胞生物学第2章免费版
电 镜 样 品 的 制 备
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2.2.2 Transmission Electron Microscope
◆冰冻蚀刻术(freeze-etching) 冰冻蚀刻术(freeze(freeze 是专门观察样品外表面的投影 复型术。 复型术。
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冰 冻 蚀 刻 技 术
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2.2.3 Scanning Electron Microscope 原理： 原理： 目前一般扫描电镜的分辨率约60～ 10nm) nm)。 目前一般扫描电镜的分辨率约60～100 Å(6～10nm)。 60 ( 2.2.4 Scanning Tunneling Microscope,STM ◆基本原理 2.2.4 扫描隧道显微镜 扫描隧道显微术在生命科学中的应用 ◆DNA结构研究； DNA结构研究； 结构研究 胶原、纤维和蛋白质结构研究； ◆胶原、纤维和蛋白质结构研究； 细胞膜表面结构的研究。 ◆细胞膜表面结构的研究。
932年德国学者 年德国学者Max Knolls和 1932年德国学者Max Knolls和 Ruska用波长比光短得多的 Ernst Ruska 用波长比光短得多的 电子作光源, 电子作光源 , 发明了第一台电子显 微镜，大大提高了显微镜的分辨率， 微镜，大大提高了显微镜的分辨率， 开拓了超微世界。 开拓了超微世界。
20
放 射 自 显 影 术
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2.5 分析细胞学技术
2.5.1 流式细胞术 (Flow cytometry) n流式细胞器 (Flow cytometer,FCM)
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流 式 细 胞 术
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细 胞 分 选
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细 胞 标 记
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染 色 体 分 选
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染 色 体 标 记
细胞生物学复习要点(王金发版)
名词解释：细胞学说：细胞学说是1838～1839年间由德国的植物学家施莱登和动物学家施旺所提出,直到1858年才较完善。
它是关于生物有机体组成的学说，主要内容有：①细胞是有机体，一切动植物都是由单细胞发育而来，即生物是由细胞和细胞的产物所组成；②所有细胞在结构和组成上基本相似；③新细胞是由已存在的细胞分裂而来；④生物的疾病是因为其细胞机能失常。
细胞全能性：分化细胞保留着全部的核基因组, 它具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息, 即能够表达本身基因库中的任何一种基因, 也就是说分化细胞具有发育为完整个体的潜能, 称为全能性。
分辨率：指能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力，这种距离称为分辨距离。
分辨距离越小，分辨率越高。
一般规定∶显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称为分辨率。
冰冻蚀刻技术：是在冰冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。
如果将冰冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。
当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂-碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，置于载网上作电镜观察。
放射自显影：放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。
分子杂交：不同来源或不同种类生物分子间相互特异识别而发生结合的过程。
如核酸（DNA、RNA）之间、蛋白质分子之间、核酸与蛋白质分子之间以及自组装单分子膜之间的特异性结合。
PCR技术：在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断处于变形、复性和合成的循环中，达到扩增目的基因的目的。
细胞群体培养克隆培养原代培养：指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。
王金发《细胞生物学》网络课件讲义全集
王金发《细胞生物学》网络课件讲义全集课程学习：1.细胞概述>>目录1. 细胞概述1.1 细胞的发现及细胞学说的创立1.1.1 细胞的发现1.1.2 细胞学说(cell theory)的创立1.1.3 细胞学理论对细胞学发展的推动作用1.1.4 细胞生物学发展简史1.2 细胞的基本功能和特性1.2.1 细胞的基本功能1.2.2 细胞结构上的相似性1.2.3 细胞的形态1.2.4 细胞的大小及体积的恒定1.2.5 细胞及细胞器的计量单位1.3 细胞的分子基础1.3.1 水是细胞中最主要的物质1.3.2 无机盐1.3.3 小分子有机小分子1.3.4 生物分子的功能分类1.3.5 细胞结构体系的组装1.4 细胞的类型和结构体系1.4.1 原核细胞1.4.2 真核细胞的两种主要类型:动物细胞和植物细胞1.4.3 真核细胞的结构体系1.4.4 真核细胞与原核细胞的比较1.5 病毒--非细胞的生命体1.5.1 病毒是比细胞更小的生命体1.5.2 病毒的生活史1.6 细胞生命的进化1.6.1 细胞生命的起源与进化1.6.2 真核细胞的起源1.6.3 从单细胞向多细胞进化1.7 我国细胞生物学的发展战略1.7.1 细胞生物学的主要研究内容和发展方向1.7.2 我国细胞生物学发展战略学习指导课程学习：1.细胞概述>> 1.1.1 细胞的发现1. 细胞概述所有的生物都是由细胞(cell)构成的。
除了病毒、类病毒等是非细胞的生命体以外，其它生命有机体的结构和功能单位都是细胞。
细菌、酵母等微生物是以单细胞的形式存在，而高等动、植物则是由多细胞构成的，如人大约有3 ×1013个细胞，这些细胞组成不同的组织和器官。
研究细胞及其生物学功能的科学称为细胞生物学(cell biology)。
1.1 细胞的发现及细胞学说的创立第一个发现细胞的是英国学者胡克(Rorbert Hooke)，相隔170多年后，德国植物学家施来登(Mathias Schleiden)和动物学家施旺(Theodor Schwann)创立了细胞学说。
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第二章细胞生物学研究方法
细胞生物学以细胞为研究对象，从细胞的整体水平、亚显微水平、分子水平三个层次，以动态的观点研究细胞和细胞器结构和功能、细胞生活史和各种生命活动。
1．细胞结构、成分的观察-显微成像技术
原理：照明系统发出的光线或电子束通过样品时，与样品发生相互作用，其被改变的物理特征被肉眼观察或通过探测器检测而成像。
分辨率：r=0.61λ/nsinα；分辨极限：一定波长的射线不能用以探测比它本身波长短得多的结构细节。
1.1普通光学显微镜及样品制备
1.1.1各种光学显微镜
普通光学显微镜
荧光显微镜：利用紫外线为光源照射样品，使之发生荧光。
相差显微镜：将不同成分的衍射系数改变为明暗变化。
暗视野显微镜：利用散射或衍射光增大反差。
倒置显微镜：普通光学显微镜的倒置。
1.1.2样品制备
取材、固定（杀死细胞，稳定细胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、染色、观察。
放射性自显影：放射性同位素标记、底片。
1.2电子显微镜及其样品制备
1.2.1电子显微镜
透射电子显微镜
照明系统为电子束，电磁透镜调整电子束的亮度与聚焦，真空系统保护电子枪等。
扫描电子显微镜
极狭窄电子束扫描样品，利用样品表面形成的二次电子信号成像。
扫描透射电子显微镜
透射电子显微镜与扫描电子显微镜的结合：电子束扫描，透射电子成像。
1.2.2样品制备
步骤：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（负染色等）、观察（放在载网上）。
负染色：利用重金属盐对样品进行染色，电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。
喷镀技术：以一定角度在样品的表面镀上一层金属，增强背景和待观察样品反差
的方法。
冷冻断裂复型和冷冻蚀刻：生物样品在液氮中迅速冷冻，然后迅速放入冷冻装置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后观察切口表面；或将其温度稍微升高，使样品中的冰升华，会在表面浮雕出细胞膜的超微结构。
1.3间接成像技术
扫描隧道显微镜：利用量子力学的隧道效应，探针尖端与样品表面可产生隧道电流，其值与距离呈指数变化关系。
原子力显微镜：扫描隧道显微镜修改，利用探针原子与样品表面的原子力的变化。
X射线衍射技术：在原子分辨的水平上推测分子的结构。
2．细胞成分的组成、分布-细胞化学技术
2.1酶细胞化学技术
初级反应：细胞内酶作用于底物产生初级反应产物。
捕捉反应：初级反应产物与捕捉剂相互作用，产生显微镜下可见的最终反应产物。
2.2免疫细胞化学技术
利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布。
包括免疫荧光技术和免疫电镜技术。
2.3其它
显微分光光度术、显微荧光光度术用来对相关成分进行定性、定量、分布的观察。
核磁共振技术分析有机化合物结构。
3．细胞及成分的分离-细胞分选技术、分离技术
3.1细胞分选技术
流式细胞仪：流室，激光光源，讯号检测器，讯号分析部件，无细胞液滴收集器。
细胞分选过程：细胞液经流室形成单细胞悬液，激光检测带有荧光标记的细胞，信号检测分析使液滴充电，经电场分选进入无细胞液滴收集器。
3.2分离技术
3.2.1离心分离技术
（1）速度离心分离细胞器和大分子
在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降速度也就不同，体积大的沉降快。
差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
移动区带离心：利用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，较长时间的离心。
建立密度梯度的原因使防止扩散，但任一组分的密度都大于连续密度的最大值。
（2）等速度离心分离细胞器和大分子
利用介质产生一种密度梯度，覆盖了待分离物质的密度，通过离心使不同密度的颗粒停留在相应的介质密度区。
介质可以是蔗糖或甘油，其密度较小，适于分离细胞器等；或利用CsCl，能够自发建立密度梯度，同时密度比较大，适合分离DNA,RNA等。
3.2.2层析分离技术
根据混合物中各组分在物理化学性质等方面的差异在固定相与流动相间进行反复多次的分配而得以使各组分的移动速度产生差异而分离。
（1）凝胶过滤层析
根据蛋白质的大小和形状进行分离纯化。
（2）亲和层析
根据生物分子中有些分子的特定结合特性分离纯化成分。
（3）离子交换层析
根据蛋白质在不同pH环境下具有不同的带电特性，而与固定相的特定电荷相互作用而分离纯化。
4．细胞培养-细胞工程技术
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体取出的细胞。
4.1培养条件
注意三个环节：营养、生存环境、废物的排除。
4.2培养过程
原代细胞培养产生细胞系，再经传代培养得到具有特殊性质或标志的细胞株。
4.3培养方法
悬浮培养、贴壁培养。
5．与其它学科结合的相关技术-单克隆抗体技术、显微操作技术、分子生物学方法等
5.1单克隆抗体技术
B细胞与突变的骨髓肿瘤细胞发生细胞融合，产生既能产生单一抗体，又能不断增殖的杂种细胞。
5.2显微操作术
用于对细胞的解剖手术及微量注射的技术。
5.3分子生物学方法
5.3.1基因工程
选择目的基因构建工程质粒，导入载体中表达，产生产品或进行基因功能的分析。
5.3.2PCR技术
复制目的DNA片段。
步骤：引物设计和合成、DNA模版的制备、PCR反应、产物的分离和纯化。
5.3.3选择性基因Knockout和转基因鼠
目的基因插入正选择标记基因，末端插入负选择标记，导入胚胎干细胞，进行基因重组，然后筛选出正确重组的细胞，培养出杂种小鼠，经过两次交配得到纯合的基因knockout鼠。
5.3.4乳腺生物反应器技术
根据细胞生物学中蛋白质的合成与分选的机理，结合基因工程技术、生物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某种具有重要价值的基因产物。