组织芯片与临床病理

组织芯片与临床病理首都医科大学附属北京天坛医院张丽敏1998 年， Konoen 等在美国 NatureMedicine 上发表了制作组织芯片用于乳腺癌 p53 基因扩增及其表达蛋白水平的研究，并首次提出了组织芯片的概念。

随后 Moch 等对肾癌，Scharan 等对不同类型肿瘤， Richter 等对尿道膀胱癌的组织芯片进行了免疫组织化学和原位分子杂交等研究，使得世人对组织芯片有了进一步的认识。

一、组织芯片的概念和特点（一）组织芯片的概念：组织芯片 (tissuechip) ，又叫组织微阵列(tissuemicroarrays ， TMA), 是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行同一指标的原位组织学研究。

组织芯片是生物芯片技术的一个重要分支。

组织芯片与基因芯片和蛋白质芯片一起构成了生物芯片系列，使人类第一次能够有效利用成百上千份组织标本，在基因组、转录组和蛋白质组三个水平上进行研究，被誉为医学、生物学领域的一次革命。

组织芯片技术作为一项新兴的生物学研究技术，正以它绝对的优越性展示着自己的潜力。

（ ppt5 ）图表显示的是组织芯片与基因芯片、蛋白芯片的区别。

（二）组织芯片的特点：体积小，信息含量大，获得大量结果，减少试验误差。

省时、省力、经济，有利于原始蜡块的保存。

二、组织芯片的分类（一）根据芯片上样本含量的多少：可分为低密度芯片 (<200 点 ) 、中密度芯片(200 ～ 600 点 ) 和高密度芯片 (>600 点 ) 。

目前国际上常用的 TMA 的标本量多为 60-100 个，组织片的直径在 2mm 左右。

一般情况下，在直径 2mm 的组织片上有约 100000 个细胞，而直径 0.6mm 的组织片上仅有约30000 个细胞。

（二）按组织来源：可分为人类组织芯片、动物组织芯片和肿瘤组织芯片。

1. 人类组织芯片又分为正常组织芯片、疾病组织芯片和胚胎组织芯片；其中的疾病组织芯片又分为恶性肿瘤组织芯片、良性肿瘤组织芯片和其他疾病组织芯片。

2. 肿瘤组织芯片可以分为多肿瘤组织芯片、肿瘤进展组织芯片和预后组织芯片。

多肿瘤组织芯片是由多种类型肿瘤组成，用于肿瘤基因和 / 或相关基因的筛选；肿瘤进展组织芯片由不同发展阶段的肿瘤组织组成，包括癌前病变、甚至正常组织；预后组织芯片由治疗前后的肿瘤组织组成，用于寻找与治疗和预后有关的标志物。

三、组织芯片的优点（一）高通量：利用组织芯片技术和免疫组化技术检测 120 例胃粘膜病组织中 13 种细胞周期调控因子 (Ubipuitin 、 p16 、 p21 、 p27 、 p53 、 p57 、 cyclinA 、cyclinB 、 cyclinD1 、 cyclinE 、 CDK2 、 CDK4 、 CDK6) 的表达 , 仅用 13 张芯片就完成了全部实验 , 并获得了胃粘膜疾病中 13 种细胞周期调控因子表达的数据。

（二）高效性：组织芯片因其体积小，信息含量高省时、省力、节约经费、节省试剂。

1 ～2 周之内可完成数千个组织标本的数十个基因表达或蛋白分子的定位、定量、定性分析。

是传统病理学方法所需费用的 1/10 ～ 1/100 ，可最大限度地利用有限的标本资源 , 易于开展交流及合作。

（三）平行性：肿瘤微阵列 / 芯片技术采用同一标准选材、操作和判定结果 , 所得结果均一可靠。

（四）实验误差小：组织芯片可同时检测一种肿瘤不同阶段的基因表达状况 , 能在一张切片上同时看到一个肿瘤组织在原位、转移、复发中的基因扩增情况。

它使分析成百乃至上千个肿瘤标本中 DNA 、 mRNA 、蛋白质的工作在最短的时间内完成。

组织芯片中的众多组织都处在相同条件下进行实验，因此较传统的病理切片的实验误差小。

四、组织芯片的制备（一）挑选合格的蜡块，如（ ppt13 ）图片所示，福尔马林固定的石蜡包埋的组织块——蜡块可以长时间的保留蛋白的抗原性，蜡块是构成组织芯片的基本材料。

构建组织芯片先要根据研究目的以及蜡块的组织学特性挑选合格的蜡块，并切片进行 HE 染色判断哪个区域可被利用。

（二）将保留的组织学样本蜡块重新定位到一个新的样本群蜡块。

蜡块中挑选形态学上有代表性的区域，用转移蜡块组织专用的针在蜡块中打孔，直径为 0.6-2mm ，并转移并包埋至新的蜡块中。

样本打孔直径的大小以及组织芯片上样本的密度决定了芯片上组织样本的数目。

打孔直径小，可以避免对原始蜡块的破坏；同时也可以最大限度的取材。

（三）从新的样本蜡块中制备组织切片 , 借助特定切片辅助系统—粘着包被带卷片系统 , 对组织芯片蜡块连续切片。

切片厚度 2 ～ 3 μ m, 一般可切片 50 ～ 100 张放置在玻片上，制备成组织芯片。

（四）把设计好的蜡块放入温箱 , 根据蜡质 , 调定温箱温度 , 在半融状态下取出 , 室温冷却 , 放入 4 ℃冰箱中备用。

五、组织芯片的应用（一）在生物学、组织胚胎学及病理学的形态学教学中的应用：可将各种不同的组织器官集中在一个组织芯片上，大大减少切片储存空间，学生可根据实际需要对所学知识进行系统观察，极大的方便了学生在专业课学习过程中的预习与复习；（二）有利于形态学的比较研究：可将各种不同的组织器官集中在一个组织芯片上，可以进行比较学习；（三）用于各种免疫组织化学染色、原位杂交、原位 PCR 、荧光原位杂交、原位 RT-PCR 和寡核苷酸启动的 DNA 合成 (PRINS) 等；（四）分子流行病学：芯片上的多样本代表的是群体的研究而不是单个肿瘤的研究；（五）用于临床和基础的研究：分子诊断、预后指标筛选、治疗靶点定位、抗体和药物筛选、基因和表达分析等；（六）在病原体检测中的应用：扩增病原体特异性基因，用作 TMA 原位杂交探针或制备探针对于病原体特异性抗原的抗体进行 TMA 免疫组织化学染色，从基因或（和）蛋白质水平增加高通量原位检测组织、细胞病原体感染的可能性。

六、组织芯片与临床病理（一）组织芯片在脑胶质瘤中的应用： 50 例脑胶质瘤标本和 3 例正常脑组织标本选取典型部位制作组织芯片，检测细胞增殖核抗原 Ki-67 的表达，突变型 P53 蛋白及野生型P53 基因的表达，（ ppt19 ）图片中的图 3-5 提示阳性信号均为棕黄色颗粒， P53 、 Ki-67 蛋白主要定位于细胞核， P53mRNA 主要定位于细胞浆内。

不同病理级别 Ki-67 的表达水平存在显著性差异，如（ ppt20 ）图片中的图 6 、 7 所示，突变型 P53 蛋白与野生型 p53mRNA 之间存在显著负相关，突变型 P53 蛋白与 Ki-67 蛋白的表达水平之间存在显著正相关。

（二）组织芯片在前列腺癌中的应用：国外研究将前列腺良性增生、原发性前列腺癌、激素治疗抵抗性复发转移到前列腺癌的标本制成芯片。

结果显示，在激素治疗抵抗性的患者中胰岛素样生长因子结合蛋白高表达（ 100% ），热休克蛋白高表达（ 31% ），另有研究表明 Ki-67 标志指数从高到低依次为前列腺癌、前列腺上皮内瘤变、正常前列腺组织。

（三）组织芯片在鼻咽癌中的应用：国内中山大学构建了鼻咽癌组织芯片，分别研究了 p16 和 p53 在鼻咽癌组织中的表达。

结果表明，鼻咽癌组织中的 p53 蛋白阳性率明显高于其他非癌鼻咽组织（ p<0.01 ），说明 p53 蛋白的积累参与了其癌变过程；而 p16 蛋白在鼻咽癌组织中缺失，在正常组织中均表达。

医疗领域中应用组织芯片技术研究的肿瘤范围很广，几乎涉及全身 , 包括胃癌、大肠癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌等，用于检测同一肿瘤不同亚型中基因或蛋白产物的表达、不同肿瘤的同一指标的表达、肿瘤诊断、肿瘤分类、肿瘤的浸润与转移研究、指导肿瘤治疗、判断肿瘤预后、以及药物筛选等。

七、组织芯片研究分析组织芯片与基因芯片和蛋白质芯片一起构成了生物芯片系列，使人类第一次能够有效利用成百上千份组织标本，在基因组、转录组和蛋白质组三个水平上进行研究，被誉为医学、生物学领域的一次革命。

（一）组织芯片的优势微阵列上所有单元均为平行在位检测每一样本中 DNA 、 RNA 和蛋白质目标提供了靶。

同时，前后关联的单元可以迅速分析样本部分的几百个分子标记，以及构建未培养的人类肿瘤的相关遗传细胞型或表现型特征数据库。

不只有 DNA 或蛋白质，还有整个细胞或器官也能布置在玻璃表面上从而制得细胞芯片或组织芯片。

举例来说，如果你想要找与细胞膜受体成键的配体，你需要布置整个细胞而不是提纯受体并用其点板。

如果矩阵由不同的细胞组成，将会容易地辨认出与细胞特异性成键配体。

这种方法应用将会很广。

（二）组织芯片目前存在的问题组织芯片具有很多的优势，但是目前仍存在一些的问题。

比如肿瘤的异质性（即在同一常规切片中肿瘤组织学类型不一，分化程度迥异）常常影响人们对肿瘤的诊断与评估；同一组织取材大小及数目应该代表组织的典型病变，这可以通过多点穿孔取材加以克服；到底需要打多少个孔也是目前存在的一个问题。

（三）组织芯片技术的不足组织芯片切片厚度通常用显微镜用薄片切片机切为 4-5μm 厚度，切片过程中会出现样本丢失的情况；有些蜡块深度长短不一，样本的大小和数量受到限制、各组织柱的高度不同影响制片质量，取自短的蜡块的组织在切片过程中会提前耗尽；由于组织片过小，切片转移至玻片过程中可能会丢失，制片过程中容易引起组织片的皱褶，移位或脱落。

不能用于分析薄壁或多层组织如肠道、皮肤和血管等。

（四）组织芯片的前景近几年，组织芯片技术已经从先前的肿瘤分子病理的研究扩展到了整个临床医学病理生理的各个方面，成为了一个常规工具用于研究大量样本中的新的分子标记物以及基因量的表达变化。

随着自动图像扫描系统及分析设备的出现，数据库的建立，允许科研人员通过互联网共享图像和资料，能极大的促进其发展，在大样本、多基因、多因素分析方面发挥更大的作用。

组织芯片又被称为芯片上的实验室。

大部分芯片实验要求多步样品制备过程，例如DNA ， RNA 或蛋白质萃取倍增等，在重复时可能产生不可预知的人为误差和变化。

芯片实验室的成功，将会使得带一个测试芯片去任何地点测试生物学的样品，并进一步实时实地得到想要的数据成为可能。

组织芯片对人类基因组学的研究与发展，尤其对基因和蛋白质与疾病关系的研究，疾病相关基因的验证、新药物的开发与筛选、疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面具有实际意义和广阔的市场前景。