基因工程中常用的三种工具酶
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程的基本工具(A)
基因工程的基本工具（A）［知识梳理］实现这一精确的操作过程至少需要三种工具即准确切割DNA的“手术刀”——限制性核酸内切酶、将DNA片段再连接起来的“缝合针”——DNA连接酶、将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”——（运）载体（一）、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1、又称限制酶或（限制性内切酶）2、主要是从原核生物中分离纯化出来的是原核生物的防御机制) 3*、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，（大多数限制酶识别序列6个核苷酸组成）并在特定的切点（两个核苷酸之间的磷酸二酯键）上切割DNA分子（体现酶的专一性；注意与解旋酶的区别）4、切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——错位切：产生黏性末端。
平切：产生平口末端。
例：1）GAA TTC(写出)CTTAAG2) CCCGGGGGGCCC(二)DNA连接酶——“分子缝合针”1、两种来源不同的DNA用同种限制酶切割后，末端可以相互黏合，这种只能使互补的碱基连接起来，脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口（磷酸二酯键），需要靠DNA连接酶来“缝合”。
2、根据酶的来源不同，可以将这些分为两类：一类：从大肠杆菌中分离得到的，称为E·coliDNA连接酶；只能将双链DNA另一类；从T4噬菌体中分离出来的，称T4DNA连接酶；既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
（三）基因进入受体细胞的（运）载体——“分子运输车”1、通常利用质粒，质粒存在于许多细菌以及酶母菌等生物中。
质粒是独立于细菌（细胞）染色体外（即拟核DNA）之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
质粒上有决定固氮、抗药性、抗生素生成的基因（可作为标记基因）。
2、作为运载体的特点：1）、有一个到多个限制酶的切割位点；(供外源DNA片段(基因)插入其中)2）、能进行自我复制；(在细胞中自称复制，或整合到染色体DNA上，随染色体进行同步复制)。
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
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04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程常用的工具酶
四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度：
反应温度：
DNA的分子结构：
酶缓冲液组成： 甘油浓度：
MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）： 牛血清白蛋白（BSA）：
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA：
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA：
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶） 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
与识别位点一致 Mg2+
低
高
EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种
基因工程原理
基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。
基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。
该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。
3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。
根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。
Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。
第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。
4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。
基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶连接酶和T4-DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。
粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。
平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。
同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。
基因工程的基本工具_基因工程的原理及技术_基因工程和蛋白质工程的应用-高中生物知识点
基因工程的基本工具_基因工程的原理及技术_基因工程和蛋白质工程的应用-高中生物知识点·基因工程基因工程三种工具原理及基因工程的四个步骤一、基因工程需要三个工具：1、剪刀：限制酶。
2、针线：DNA连接酶。
3、运输：运载体。
二、基因工程四个步骤：1、目的基因的获取。
2、基因表达载体的构建目的基因与运载体结合。
3、将目的基因导入受体细胞。
4、目的基因的检测与表达。
基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术。
是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程，又称基因操作，DNA重组技术，基因克隆，分子克隆等。
克隆就是来自同一祖先的相同副本或拷贝的集合，而获得同一拷贝的过程则称为克隆化，也就是无性繁殖。
蛋白质工程是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。
1983年，美国生物学家厄尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念，随即被广泛接受和采用。
蛋白质工程是以蛋白质结构与功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的蛋白质。
人们利用分子遗传学的知识和对蛋白质结构的了解，在实验室条件下，设计出全新的优良蛋白质。
利用基因工程生产的胰岛素就是蛋白质工程的第一个成功范例。
由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有许多同基因工程技术相似的地方，因此人们也把蛋白质工程称为第二代基因工程。
蛋白质工程与基因工程的区别蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。
蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
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一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。
如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。
4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。
若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。
限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。
多数限制酶错位切开dsDNA，产生5′or 3′-单链互补顺序，称为5′or 3′-粘性末端（sticky or cohesive ends），如HindⅢ、PstI。
5．反应条件：限制酶酶切反应的影响因素如下：（1）DNA的纯度限制酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所使用的DNA本身的纯度。
提取DNA时，蛋白质、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐等都有可能抑制限制酶的活性。
小量制备的DNA尤其会遇到这种问题。
RNA一般不影响酶的反应速度，但它能和蛋白质发生非特异性结合，从而减少酶的有效浓度。
少量蛋白质污染不影响酶活性，但如果是Dnase污染则会导致DNA的降解，它可能来源于溶解DNA的试剂溶液或者酶解缓冲液的组分。
由于Dnase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的储存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，一般用1mmol/L EDTA溶液（TE）溶解DNA，在保存DNA的过程中因为是低温，Dnase不会有活性，一旦将DNA加入反应体系，EDTA的浓度降低，在37℃温度下反应时，Dnase的活性就会发挥出来。
混杂的结合蛋白则与DNA结合，不仅会封闭酶的识别序列影响酶解，而且形成的DNA—蛋白复合物将干扰DNA的电泳行为。
要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。
为了提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下4种措施：①增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多。
②增加酶反应体系的体积，以使潜在的抑制物被相应的稀释。
③延长酶解反应的保温时间。
④向反应体系中添加亚精胺（spermidine）（终浓度为1~2.5mmol/L），亚精胺与负电性的杂质结合。
注意，亚精胺在4℃时会沉淀DNA，因此最好在反应已经保温数分钟后再加入。
DNA本身如果降解了，便无法挽救。
但有时DNA纯度很好，不存在上面所述的问题，酶解效果不好就可能有两种原因，一是DNA没有溶解充分，加入反应体系的DNA比计算的量多得多，使反应体系粘度太大，影响了酶分子的扩散或酶用量相对不足；二是DNA用量虽不过量但由于混合不均匀，也会影响酶解效果。
（2）识别序列的甲基化程度限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈影响酶的活性。
通常从大肠杆菌宿主细胞中分离出的质粒DNA，都混有dam甲基化酶及dcm甲基化酶，前者催化GA TC序列中的A甲基化；后者催化CCA/TGG序列中的C甲基化。
因此，在基因克隆中要使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。
（3）酶切反应的温度不同的限制酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。
大多数限制酶的最适温度在37℃，但有许多例外的情况，如SmaⅠ是25℃；MaeⅠ45℃、BclⅠ50℃、MaeⅢ55℃、BstⅡ60℃、TaqⅠ65℃等等。
（4）DNA的分子结构DNA分子的不同构型对限制酶的活性也有很大影响。
某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高可达20倍。
还有一些限制酶切割不同部位的酶切位点，其效率有明显的差别。
（5）酶解缓冲液各组分的影响使用不适宜的酶解缓冲液，常是导致酶解效果不好的原因。
缓冲液要新鲜配制，各种离子及其浓度要准确，pH要调准。
在反应条件不恰当时，某些限制酶会出现“星号”活性，即它们不再严格遵循从识别序列酶解DNA，而会在其他的序列切断DNA，如EcoRⅠ，其“星号”活性表现在它自AATT序列处切断DNA。
Tris-HCl缓冲液是比较理想的限制酶反应缓冲体系，在pH7.4~8.0有较大的缓冲容量。
Mg2+是酶的激活剂，终浓度一般需在5mmol/L以上，如果反应体系中存在螯合剂（如EDTA 和枸橼酸），游离Mg2+的浓度会减少，使酶活性下降。
当Mg2+被其他二价金属离子（如Mn2+、Co2+或Zn2+）取代时，不仅会影响酶的活性还会改变酶的识别特异性。
反应体系中的NaCl仅提供一定的离子强度。
不同的酶要求不同的NaCl浓度。
个别的酶需要其他的离子，如SmaⅠ绝对需要K+，PstⅠ更易被NH+4激活。
大部分缓冲体系中含二巯基乙醇（BSH，1~10mmol/L）或二硫苏糖醇（DTT，1mmol/L）。
加入巯基化合物的目的是为了去除一些能与巯基去反应的化合物对酶的抑制。
但不是所有的酶都需要添加巯基化合物，如EcoRⅠ、HindⅢ等；而BamHⅠ、AvaⅠ、PvuⅡ和SmaⅠ非要巯基化合物不可。
不需要者可省去，需要者则应新鲜配制。
反应体系中的牛血清白蛋白（BSA）或白明胶是用来稳定酶活性的。
当反应体系中蛋白浓度低于20ug/μl时，有些酶就会极不稳定。
加入BSA后，不仅可减少蛋白的降解，而且还能减轻非特异吸附造成的酶蛋白丢失。
但所用的BSA纯度较高，不含Dnase。
用白明胶可代替BSA。
但过量的BSA也会与DNA结合而影响DNA的电泳分离。
水的质量不容忽视，所用的水应该是无离子及有机化合物的玻璃器皿重蒸水，去离子水也能满足要求。
（6）酶活性限制酶的单位：在限定条件下，1小时消化1μg DNA所需的酶量为1单位。
这是最为重要的。
比活较低的酶，因加入的酶溶液体积大，常有甘油浓度太高的问题，为了避免甘油浓度高于5%，反应体系体积较大，对下步的电泳操作带来不便。
此外，某些酶由于保存时间长，活性降低（以至失活），或者反复取用受到污染或暴露于室温时间太久，也会导致酶活性降低。
因此在进行重要样品酶解前最好测定酶活性的强弱，以免损失样品。
二、T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离的。
能催化两个DNA片段的3′-OH和5′-磷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，将两个片段连接成为一个共价结合的DNA分子。
三、逆转录酶（reverse transcriptase）又称依赖RNA的DNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase，RDDP）。
属于多功能性酶。
1．RDDP：以mRNA为模板，以带3′-OH的DNA片段为引物合成cDNA。
2．外切RNA酶活性：底物是RNA-DNA杂化分子中的RNA链。
从RNA链5′-端外切者称为5′→3′外切RNA酶；从RNA链3′-端外切者称为3′→5′外切RNA酶，也称RNA酶H。
3．依赖DNA的DNA聚合酶：以单链DNA为模板，以带3′-OH的DNA片段为引物，从5′→3′方向合成dsDNA。
原文地址:/biotech/exp/molbio/DNA/2010/v8831333.html。