抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化
一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定
一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定郭春燕;王旭正;刘少杰;于金凤【摘要】采用平板对峙法与灰色关联度分析法从小麦和苹果根际土壤中筛选出对小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)和小麦根腐病(Bipolaris sorokiniana)具有良好拮抗作用的放线菌,并依据菌落形态和培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等进行鉴定.结果表明,菌株FX-H-51抑菌效果显著,对不利生长环境有良好的耐受性.形态学与分子鉴定结果表明,菌株FX-H-51为海棠链霉菌(Streptomyces spectabilis).%Actinomycetes with strong antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana were screened out from wheat and apple rhizosphere soil by plate confrontation method and grey correlation degree analysis. They were identified according to the colony morphology and culture characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. The results showed that the FX-H-51 strain had significant antibacterial effect and better tolerance to the unfavorable growth environment. The morphological and molecular identification results indicated that the FX-H-51 strain was to Streptomyces spectabilis.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)004【总页数】5页(P43-47)【关键词】放线菌;灰色关联度分析;拮抗活性;海棠链霉菌【作者】郭春燕;王旭正;刘少杰;于金凤【作者单位】山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018;山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018;山东省烟台农业学校,山东烟台265100;山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018【正文语种】中文【中图分类】S154.3放线菌是陆生性较强的原核生物，同时也是一类具有重要经济价值和生物研究价值的微生物资源，其中链霉菌属(Steptomyces)的放线菌在植物病害生物防治中已有较多的研究报道。
一株拮抗放线菌的分类鉴定与发酵条件优化试验
２ 结果与分析
２１ 菌株 鉴定 ． ２１ ．． 形 态特征 １ 在 高 氏 １ 固体 培养 基 ，于 ２ ￣ 号 ８Ｃ培养
１ ． 培养 特征 与生理 生化 特性 将 菌株接 种 到培养 基 ．２ ２ 上 ，于２ ℃下恒 温培 养 ，观 察 并记录 菌株 的培养 特征 与 ８
生理生化特性 ， 。
Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ ３ ，序列 由上海 生工生物 工程技术服 务 Ｃ ＡＧ Ｃ Ａ．’ 有 限公 司合 成 。Ｐ Ｒ反应 体 系 为 ：ｄ Ｔ ｘｕｅ ４ Ｃ Ｎ Ｐ Ｍｉｔｒ 山， ５ Ｐｉ Ｓ ＡＲ Ｂ ｆ ｒ １ ｕ，上 下游 引物 各０６ ，基 因组 ｘｒ ｍｅ Ｔ ｕｆ ０ ｌ ｅ ．ｄ ｒ 模板约０８ｔ ｒ Ｓ Ａ ＨＳＤＮ Ｐ ｌｍ ｒｓ ． ａ ． ｌ ｉ Ｔ Ｒ Ａ ｏｙ ｅａｅ０６ ，用 ｒ，Ｐ ｍｅ ０ 无 菌 去 离 子 水 补 充 至 ５ ｍ 。Ｐ Ｒ循 环 参 数 为 ： ９ Ｏ Ｃ ５℃ ５ ｉ；９ ℃ ｌ ｎ ８ １ｓ ２ ２ ｎ ０ 循环 ；７ ａ ｒｎ ４ ｍｉ，５ ℃ ５，７ ℃ ｍｉ，３个 ２ ℃ ｌｍｉ。将Ｐ Ｒ反应产 物送 上海 桑尼 生物 科技 有限公司 Ｏ ｎ Ｃ 测序 ，测序结果应用ＤＮ ｔ 软件 下的Ｍｅ Ａ ｉｎ ＡＳａ ｒ ｇ ｌ 子软件进 ｇ
Ｆｓ ｙｓ 进行分类鉴 定， 同时对其发 酵液的抑 菌活性 进行 了研究 。结果表 明，菌株Ｆ ｓ ｙｓ 为链霉 茵属，其发酵液对革 兰氏 阳性 细菌具有抑制作 用，适 宜发 酵条件 为发 酵培 养基 最适初始ｐ 为８ ，培养 时间５ ，培养温度２ ℃，培 养转速２０ｐ Ｈ ． ０ ｄ ８ ｌ ｍ。 ｒ 关键词 放 线菌 分 类鉴 定 发 酵液 发 酵条件
２１年第 ８ （ ０１ 期 总第 １５ ７
苹果腐烂病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化的开题报告
苹果腐烂病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化的开题报告一、研究背景苹果是我国的主要水果之一，但在生长和储存过程中容易出现腐烂现象，导致苹果产量和品质下降，给果农和消费者带来了经济损失和健康问题。
目前，化学农药是控制苹果腐烂病的主要手段，但使用化学农药对环境和人体健康都存在一定的风险。
因此，寻找一种安全、高效的生物防治方法成为了苹果腐烂病病害控制的研究热点。
放线菌属微生物广泛存在于自然界中，具有广泛的生物活性和生态功能。
已有报道表明，放线菌具有很好的抗菌和拮抗作用，可用于蔬菜和水果等作物的生物防治。
因此，本研究拟通过筛选和鉴定苹果腐烂病菌的拮抗放线菌，并对其发酵条件进行优化，为苹果腐烂病生物防治提供技术支持。
二、研究内容1. 筛选苹果腐烂病菌的拮抗放线菌。
利用对苹果腐烂病菌具有拮抗作用的放线菌进行深度筛选和鉴定，进一步确定其拮抗效果。
2. 对拮抗放线菌的发酵条件进行优化。
通过改变拮抗放线菌的发酵条件，如温度、pH值、培养基配方等，优化发酵条件，提高拮抗放线菌的抑菌效果。
3. 构建苹果腐烂病的预防与控制模型。
利用最优条件下发酵得到的拮抗放线菌制备相应的生物制剂，构建苹果腐烂病的预防与控制模型，评价生物制剂对苹果腐烂病的抑制效果。
三、研究意义本研究的完成将有助于：1. 了解苹果腐烂病菌的抑菌机理和拮抗放线菌的特性。
2. 筛选并鉴定一株高效的拮抗放线菌，并对其发酵条件进行优化。
3. 构建苹果腐烂病的预防与控制模型，为生物制剂的研制和应用提供技术支持。
4. 推广和应用生物制剂，降低化学农药对环境和人体的影响，保障苹果产业的可持续发展。
四、研究方法1. 采用琼脂扩散法对放线菌的拮抗作用进行初筛，对拮抗效果较好的菌株进行鉴定。
2. 通过单因素试验和正交试验等方法，优化放线菌的发酵条件，包括温度、pH值、培养基配方等。
3. 利用超滤等方法制备生物制剂，对苹果腐烂病进行预防与控制效果评价。
五、研究预期结果1. 筛选到具有强抗菌作用的拮抗放线菌。
黄瓜灰霉病拮抗放线菌7-16的筛选及发酵条件优化
放 线 菌 产 生 的抗 生 素及 其 次 生 代 谢 产 物 在植 物 病 害 防 治 中具 有 重 要 的 作 用 。在 目前 已发 现 的 １０ ０多 种 微 生 物 来 源 ０
７０培养基 ３ 淀粉 ５０ 、 生饼 粉 ２５ 、 母粉 ００％ 、 ．； ： ．％ 花 ．％ 酵 ．８ 葡 萄 糖 ０ ０ ％ 、 Ｎ Ｏ ． ８ 、 ａ Ｏ ． ２ 、 ａ １ ．２ （ Ｈ ）Ｓ ０ ０ ％ Ｃ Ｃ ３０ ３ ％ Ｎ Ｃ
一
１４ 一 １
江苏农业科学
２１ ０ １年第 ３ ９卷第 ４期
关 丽杰 ， 国梁 ， 谭 杨 迪 ， 等．黄 瓜 灰 霉病 拮 抗 放 线 菌 ７—１ ６的 筛选 及 发 酵 条 件 优 化 ［ ］ Ｊ ．江 苏 农 业 科 学 ，０ １３ （ ：１ ２ １ ，９ ４） １４—１６ １
黄 瓜 灰霉 病 拮 抗 放 线 菌 ７一ｌ ６的筛 选 及 发 酵 条 件优 化
分别 调 至 ３０、． ５ ０ ６ ０、． 、． 、 ． ， 最 佳 发 酵 温 度 ． ４ ０、． 、． ７ ０ ８ ０ ９ ０ 在
基 。 （ ） 酵 时 问 对 抑 菌活 性 的影 响 ： 基 础 培 养 基 ｐ 值 凋 １发 将 Ｈ
为 ７ ０ 装 样 量 为 ４ （ ５ Ｌ三 角 瓶 ）２ １０ｒｍ ｎ分 ．， ０ｍＬ ２ ０ｍ ，８ｏ ５ ｉ Ｃ、 ／ 别 发 酵 培 养 ２ ３４、 、 ７、 ｄ 生 物 测 定 确 定 最 佳 发 酵 时 间 。 、 、 ５６、 ８ ， （ ） 酵 温 度 对 抑 菌 活 性 的 影 响 ： 基 础 培 养 基 ｐ 值 调 为 ２发 将 Ｈ ７ ０ 装 样 量 为 ４ Ｌ ２ ０ｍＬ三 角 瓶 ）分 别 于 ２ 、４ ２ 、２ ．， ０ｍ （５ ， ０ ２ 、８ ３ 、 ３ 、０℃温 度 下 培 养 ，５ ｍ ｎ发酵 ４ｄ ， 物 测定 确 定 最 ６４ １０ｒ ｉ ／ 后 生 佳 发 酵 温度 。 （ ） 始 ｐ 对 抑 菌 活 性 的 影 响 ： 装 样 量 为 ３初 Ｈ 在 ４ Ｌ ２ ０ｍ ０ｍ （ ５ Ｌ三 角 瓶 ） 条 件 下 ， 基 础 培 养 基 初 始 ｐ 值 的 将 Ｈ
植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究
标题：植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究一、引言植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究，是近年来植物保护领域的热门研究方向之一。
本文将从深度和广度两方面对这一主题展开全面评估，以期帮助读者更全面、深入地了解该领域的相关知识和研究进展。
二、植物病原真菌拮抗菌筛选1. 筛选方法植物病原真菌拮抗菌的筛选方法多样，包括体外筛选法、田间筛选法、植物病原真菌生物学特性的筛选法等。
其中，体外筛选法是目前应用较为广泛的一种方法。
2. 筛选指标在进行拮抗菌筛选时，需根据具体情况确定筛选指标，通常包括抑菌圈直径、拮抗活性指数、有效抑制率等。
通过严格的实验设计和数据分析，可筛选出具有良好拮抗活性的菌株。
三、植物病原真菌拮抗菌鉴定1. 鉴定方法植物病原真菌拮抗菌的鉴定方法主要包括生理生化鉴定、分子生物学鉴定和形态学鉴定等。
这些方法可以相互印证，提高鉴定结果的准确性和可靠性。
2. 鉴定技术近年来，随着生物技术的发展，分子生物学鉴定技术在植物病原真菌拮抗菌鉴定中的应用日益广泛，其高效、快速的特点为鉴定工作带来了便利。
四、植物病原真菌拮抗菌抑菌机理研究1. 抑菌机理植物病原真菌拮抗菌的抑菌机理通常包括竞争性排除、产生抑菌物质、拮抗菌调控宿主免疫反应等。
深入研究拮抗菌的抑菌机理有助于更好地理解其生物学特性和应用潜力。
2. 抑菌物质拮抗菌产生的抑菌物质在植物病原真菌的生长和发育中发挥着重要作用，因此对其抑菌物质的研究具有重要意义。
通过分离、纯化和结构鉴定，可为该领域的进一步研究和应用奠定基础。
五、个人观点与总结植物病原真菌拮抗菌的筛选、鉴定和抑菌机理研究，是一个既具有理论意义又具有应用价值的领域。
通过对这一主题的深度研究，我们可以更好地理解拮抗菌的生物学特性和抑菌机理，为植物保护和农业生产提供更多的技术支持。
在撰写本文时，笔者深入研究了植物病原真菌拮抗菌的相关文献和研究成果，不仅对筛选、鉴定和抑菌机理有了更深入的理解，也为未来的研究和实践积累了宝贵的经验。
缙云山土壤拮抗放线菌的分离、筛选与发酵条件优化
ｊ 一２ ｈ ｗ ｄｔｅｉｈｂｔ ｎｒｔ ｂ ｔ ｅ ｎ４ ． ｔ ５ ７ ％．Ｔｈ ｐｉ ｌ ｅｍｅ ｔｔ ｎｃ ｎ ｉ Ｙ ２ｓ ｏ ｅ ｈ ｉｉｏ ａｅ ｅｗ ｅ １ ９ ｎ ｉ ｏ７ ． ｅｏ ｔ ｒ ｎ ａｉ ｏ ｄ ｍａ ｆ ｏ —
ｔ ｎ ｏ ｎ ｉａ ｔ ｒａ ｕ ｓａ ｃ ｒ ｄ ｃｉｎ ｏ Ｙ 一２ ｒ Ｈ ｅｎ ａｕ ａ ．２ ℃ ｉ ｅ ｓ ｅ — ｉ ｓｆ ｒａ ｔｂ ｃｅ ｉｌ ｂ ｔｎ ｅｐ ｏ ｕ ｔｏ ｆ ｏ ｓ ｊ ２ ｗｅ ｅｐ ｂ ｉｇ ｎ ｔ ｒ １ ８ ｎ ｙ ａ ｔｐ ｐ
小麦纹枯 病 菌、 橘疮 痂病 菌 、 云纹叶枯 病 菌和柑橘 青 霉病 菌都 具 有较 强 的拮 抗 作 用 ， 茵 率达 柑 茶 抑
４ ． ％～７ ． 。通过 单 因子 和正 交试验 对拮抗放 线 茵 Ｊ ２ １９ ５７ Ｙ一２进行发 酵条件 的研 究 ， 结果表 明 ， 其
最佳 培养基 组成 和培 养条件 为 ： ０ ｍＬ培 养基 中含 葡 萄糖 ２ ０ 、 １ ０ ０ ． 玉米粉 １ ５ 、 ． 黄豆 粉 ３ ０ 、 ．
ｎ ｒ ａ ａｌｅ ｎａ ｅ，Ｂｉ ｌ ｉ ｙｄｉ ａ ｉ ｔｒ ｔ ｐｏ ａｒ ｓｍａ ｓ，Ｆｕｓ ｉ ｍ ｘｙｓ ｒ ｍ ，Ｃｅ ａ ｏ ａ ｉ ｕ ｃ ｒ ｇｅ ｕ ，Ｓｐｈａ ｅ ａｒ ｕ ｏ ｐｏ ｕ ｒ ｔ ｂ ｓ ｄｉ ｍ ｏ ｎｉ ｒ ｍ ｃ—
ｌｍａｆｅ ｅｔ ，Ｃｏｌｔｔｉｈ ｍ ａ ｌａ ａ ｄ Ｐｅ ｉｉｌｕ ｉａ ｉｕ ． Ｔｈ ｅ ｕ ｔ ｎ ｉａ ｅ ｈ ｔ ｏ ｗｃ ｔｉ ｌｅｏ ｒｃ ｕ ｃ ｍｅｉ ｅ ｎ ｎｃｌｉ ｍ ｔ ｌｃ ｍ ｅ ｒ ｓ ｌｓ ｉ ｄｃ ｔｄ ｔ ａ
２１ ０ ０年 第 ８期
烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化
烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化Abstract：In order to screen the bacterial strains which have antagonistic effects on Phytophthora nicotianae and provide favorable resources for the biological control of tobacco black shank disease in Henan tobacco areas，the rhizosphere soil samples of healthy tobacco plants were collected from tobacco black shank disease nursery and eight bacterial strains were screened by confrontation culture method. Among them，the strain LB-9 had the strongest and stable inhibitory effect on P. nicotianae with a bacteriostatic rate of 60.6% and a broad spectrum. The strain was identified as Paenibacillus polymyxa by 16S rRNA gene sequencing analysis. The optimum fermentation medium，temperature，time and initial pH value of LB-9 were determined by single factor optimization test which has great significance to the development and application of biocontrol agents.Keywords：Phytophthora nicotianae; antagonistic bacteria; screening and identification; fermentation condition煙草黑胫病是我国烟草的主要根茎部病害，最早发生于黄淮烟区[1-3]，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，是烟叶毁灭性病害之一。
拮抗放线菌菌株FS-4发酵工艺筛选
拮抗放线菌菌株FS-4发酵工艺筛选拮抗放线菌菌株FS-4是一株具有较强拮抗活性的菌株，对多种植物病原真菌具有抑制作用。
要想将其应用于植物病害的防治，首先需要解决的问题就是菌株的发酵工艺。
本文将重点对拮抗放线菌菌株FS-4的发酵工艺进行筛选，以期为其在农业生产中的应用奠定基础。
一、菌株特性拮抗放线菌菌株FS-4是从自然界中分离得到的一株拮抗活性较强的微生物菌株，具有较高的抗病活性。
经过初步的鉴定和筛选，确定了其为一株优质的拮抗放线菌菌株，有望成为一种潜在的生物农药资源。
为了更好地发挥其拮抗活性，需要对其进行深入的研究和开发利用。
而要进行菌株的深入研究和利用，首先要解决的问题就是菌株的发酵工艺，只有通过良好的发酵工艺，才能够大规模地生产出所需的拮抗活性物质。
二、发酵培养基的筛选发酵培养基是影响微生物发酵生长和代谢产物生成的重要因素之一，合适的培养基可以提供足够的营养物质和生长条件，从而促进微生物的生长和代谢过程。
为了确定拮抗放线菌菌株FS-4的最佳发酵培养基，本研究在初步的试验基础上，筛选了多种不同成分的培养基，包括液体培养基和固体培养基。
通过对不同培养基中菌株生长繁殖情况和拮抗活性物质产量的比较，最终确定了最佳的发酵培养基组成，为后续的发酵工艺提供了重要的基础。
三、培养条件的优化培养条件的优化对于微生物的发酵生产至关重要，包括温度、pH值、发酵时间和搅拌速率等因素。
在本研究中，我们通过单因素试验和正交试验的方法，对拮抗放线菌菌株FS-4的发酵条件进行了系统的优化。
通过对不同培养温度、不同初始pH值、不同发酵时间和不同搅拌速率下菌株生长和代谢产物生成的影响进行比较，最终确定了最佳的发酵条件，为进一步的大规模发酵生产提供了重要的参考。
四、发酵工艺的建立在优化发酵条件的基础上，我们建立了拮抗放线菌菌株FS-4的发酵工艺，包括预处理、接种、发酵、分离和提取等环节。
通过对每个环节的工艺参数进行合理的设计和调整，最终建立了一个高效稳定的发酵工艺，实现了对菌株生长和拮抗活性物质产量的有效控制和提高。
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过程中出现拮抗性不稳定现象 。所以必须再次分 离得到单胞菌落后继续测定拮抗性 ,选择其最佳 。 这样才能保证放线菌多次转管后拮抗性遗传的稳 定性 。 3. 2 放线菌的发酵是一个复杂的过程 ,受很多环 境条件的影响 。除了培养基的碳氮比 、微量元素 影响之外 ,还受培养时间 、p H、温度 、通气量等因 素的影响 。在放线菌发酵的前期 ,是菌体的生长 阶段 ,营养物质被消耗 ,抗生素开始产生 ,碳源产 生有机酸 ,p H 下降 ,抗生素的量增长迅速 ,发酵中 期 ,抗生素产生迅速 。到后期 ,抗生素增长缓慢 , 72 h 后就没有增长 ,分析原因可能是由于菌体衰 老 ,细胞开始自溶 ,发酵液中终产物的积累或其它 有害代谢物使产生菌处于一种对其进一步合成产 物不利的环境中 。或者是由于抗生素合成所需的 前体和其它因子的不足造成的 。 3. 3 此试验对 159 号拮抗单胞菌进行了发酵条 件的优化 ,得到了最佳的发酵条件 ,可为进一步发 酵罐培养提供依据 ,发酵液在田间的实际防效以 及对生物持续作用娟等 :抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化
13
效果最好 ,因为它不仅对菌丝的生长有抑制作用 , 能同时具备这 3 个特点 。因此选择 159 号菌作
而且还有溶菌作用 ,持效期最长 。而其它菌株不 为筛选到的高拮抗菌株 。
表 1 16 种液体培养基成分
表 2 发酵液对病原菌的抑制率/ %
2. 2 单胞菌的拮抗性测定
菌号 104 129 136 159 171
稻瘟 40 77 94 61 98
全蚀 0 50 50 67 90
棉枯萎 麦根腐
67
51
39
61
4
44
76
64
48
96
赤霉 36 47 82 51 63
梨黑星 32 43 51 34 41
棉枯萎
麦根腐
赤霉
梨黑星
159201 159202 159203 159204 159205 159206
24h
48h
24h
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100
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53
0
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19
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0
5
100
培养基 。因此选定其为最佳的培养基配方 。 2. 4 培养时间 、p H、温度 、摇床转速对发酵液抑 菌率的影响 本试验分别测试了培养 24 , 36 , 48 , 60 , 72 , 84 ,96 ,120 h 发酵液的抑菌率 ,发现从 24 h 开始 抑菌率在不断提高 ,到接近 72 h 达到最高 90 % , 之后随着培养时间的增长抑菌率不再增加 。因此 确定 72 h 为最佳培养时间 。在测试的 p H 5. 0 , 6. 0 ,7. 0 ,8. 0 ,9. 0 这 5 个值中 ,抑菌率的最高值 在 p H 为 8. 0 时 。因此选定 p H 8. 0 为最佳 。从 表 6 中可以看出温度的变化对抗生素的产生影 响不大 ,30～34 ℃是最佳范围 。
14
微 生 物 学 杂 志 24 卷
表 4 培养时间对发酵液抑菌作用的影响
时间/ h 抑菌率/ %
24 36 48 60 72 84 96 120 30 43 73 84 90 90 87 89
表 5 p H 对发酵液抑菌作用的影响
植物病原真菌引起的植物病害是植物的第一 大病害 ,每年给粮食生产造成巨大的损失 。目前 对植物病害的防治普遍采用化学农药 ,而化学农 药对非靶标生物的毒害 、对环境的污染 、使害物产 生抗药性的问题至今仍难以解决 ,生物防治的方 法被认为是一条有效的途径 。本研究针对几种主 要的植物病害从土壤中筛选拮抗放线菌 ,并对其 发酵条件进行优化 ,以此可作为工业液体发酵的 参考 。
pH
5. 0
6. 0
7. 0
8. 0
9. 0
抑菌率/ %
31
65
81
87
68
表 6 温度对发酵液抑菌作用的影响
温度/ ℃ 26 28 30 32 34 36 38 抑菌率/ % 70 81 91 90 89 84 64
表 7 摇床转速对发酵液抑菌作用的影响
转速/ (r/ min)
100
150
12
微生物学杂志 2004 年 7 月 第 24 卷 第 4 期 J OURNAL OF MICROBIOLO GY J uly 2004 Vol. 24 No . 4
·研究报告·
抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化
刘翠娟1 ,段琦梅2 ,安德荣1
(1. 西北农林科技大学 植保学院 ,陕西 杨凌 712100 ;2. 西北农林科技大学 生命科学院 ,陕西 杨凌 712100)
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 土样 本试验采用的分离用土样采自陕 西渭北旱原 。 1. 1. 2 供试病原菌 小麦全蚀病菌 ( Geau m an2 nom yces gram i nis) 、稻瘟 ( Py ricul aria oryz ae) 、麦 类 赤 霉 菌 ( Fusari u m gram i nearu m ) 、棉 花 枯 萎 ( Fusari u m ox ysporu m ) 、梨 黑 星 ( Fusicl adi u m Pi ri n u m ( lib. ) Fuckel ) 、小 麦 根 腐 ( B i pol aris soroki niana) 。 1. 1. 3 培养基 分离筛选用培养基 :高氏 1 号 ; 拮抗试验用培养基 : PDA ;发酵试验用培养基 : 通 用大豆玉米浸汁液体培养基 。 1. 2 方法 1. 2. 1 采集土样 选好采集地点后 ,铲去表层 土 ,用取样器取规定深度的土样 ,装入无菌牛皮纸 袋中 ,带回实验室阴干后立即分离 。 1. 2. 2 放线菌的分离 ①称取 1 g 研磨好的土 壤 ,制备稀释成 102 ,103 ,104 ,105 倍的土壤悬浮液 备用 。 ②采用涂抹法分别取上述 4 个浓度土壤稀
释液 0. 05 mL ,加入已做好的高氏 1 号培养基平 板上 ,用灭菌的玻璃刮刀将稀释液均匀涂布开 。 放入 28 ℃恒温箱中培养 。设 3 个重复 。 ③挑菌 : 根据形态将放线菌挑入高氏 1 号斜面上培养 7 d 后保存 。 1. 2. 3 拮抗放线菌的筛选 放线菌发酵液拮抗 性测定 :将放线菌接入发酵培养基 ,恒温水浴摇床 培养 ,30 ℃,培养 3 d 后 ,60 ℃水浴 15 min ,用草 酸调 p H 到 3. 5 。静置 1 h 后过滤 ,收集滤液 。取 3 mL 发酵滤液注入培养皿中 ,将熔化的 PDA 培 养基与发酵液 (约 7∶1) 混合均匀 ,冷却后接病原 菌的菌饼 。加蒸馏水和草酸作对照 。用生长速率 法计算抑制率 。由抑制率判断放线菌对病原菌拮 抗作用的强弱 。 1. 2. 4 单胞分离 将放线菌的孢子制成孢子悬 浮液 ,孢子悬浮液稀释后用平板涂抹法制成单胞 菌落 。培养 7 d 后挑入高氏 1 号斜面上保存 。并 用生长素率法继续筛选单胞菌 。 1. 2. 5 发酵培养基的选择 本研究采用 16 种不 同的发酵培养基 (表 1) ,30 ℃培养 3 d ,以稻瘟菌 作为供试的病原菌 ,生长速率法计算抑制率来表 示不同培养基中的抗生素的累积量 。 1. 2. 6 测定发酵时间 、培养基 p H、温度及摇床转 速对发酵滤液抑菌作用的影响
2 结果与分析
2. 1 高拮抗菌株的筛选 本研究共对 240 株放线菌的发酵液进行初筛 和复筛后 ,得到 5 株较好的菌株 ,再对这 5 株的抑 菌 率进行比较 ,结果见表2 。其中以1 5 9 号抑菌
收稿日期 :2003 - 06 - 10 作者简介 :刘翠娟 女 ,硕士研究生 。主要从事微生物学及土壤拮抗微生物的研究 。
95
16
67
78
51
68
65
50
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16
2
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70
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8
9
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59
80
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36
27
2. 3 发酵培养基的筛选结果 (图 1)
图 1 159206 不同培养基发酵液 对赤霉的抑制效果
从图 1 中可看出 ,1 号 、6 号 、12 号 、14 号培 养基的发酵液抑制率较高 ,其中最高的是 12 号
159 号菌株分离到 6 个单胞菌 ,分别对它们 的拮抗性进行测定 。结果 (表 3) 159206 号单胞菌 在 24 h 和 48 h 的抑菌率都是最高的 ,因此选定 159206 号单胞菌株作为发酵优化的对象 。
表 3 24h ,48h 单胞菌发酵液皿内测定抑制率/ %
菌号
稻瘟
全蚀
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16