放线菌筛选的一般方法
拮抗香蕉枯萎病放线菌的筛选与AM2041菌株的鉴定
拮抗香蕉枯萎病放线菌的筛选与AM2041菌株的鉴定本实验从海南各地采集土壤样本，从中筛选出具有对foc4拮抗作用明显的1株放线菌，并对其进行形态、生理生化、16s rdna序列及系统发育分析等方面的监督。
一、材料与方法1.供试菌株的分离菌株的分离采用高氏一号合成培养基。
在海南省海口、儋州、临高等地的8个香蕉种植园，选择香蕉枯萎病发病症状明显的香蕉树，在根系地表采集约20g土壤作为样本。
样本去除大块固体，放置在通风橱中风干10天。
每个样本称取1g，加入9ml无菌水，28℃、200r/min摇床上恒温培养一天，制成悬浮液。
静置1h后分别取上清100μl，进行101、102、103、104梯度的稀释。
稀释液分别取100μl进行涂板，每瓶重复3次。
培养皿28℃培养3天，挑取单菌落于平板上进行划线纯化，5天后进行观察。
2.拮抗菌株的筛选以本实验室所保存的菌液浓度约为109个/ml的foc4培养液作为检测样本，以琼脂挖块法进行初筛：pda平板上接种foc4培养液0.1ml,涂布均匀。
将分离得到的单菌落接种到新的pda平板上，28℃恒温培育2天，用5mm孔径的打孔器打孔，挑取带菌琼脂块放置于有foc4培养液涂布的pda平板上，每个菌株重复3次，28℃恒温培养36小时。
观察抑菌圈的情况。
筛选出的抗性作用明显且生长状况良好的菌株进行复筛。
将抗性菌株接种于snb培养液[11]中进行发酵，28℃、200 r/min摇床上恒温培养一天，室温静置1小时。
在pda平板上均匀涂布0.1ml foc4培养液后，将无菌的直径5mm滤纸贴在平板上。
取10μl抗性菌株的发酵液上清滴于滤纸中心，每个菌株重复3次，28℃培养1天。
观察菌落生长状况。
3.抗性菌株的分类鉴定形态学鉴定：将选出的抗性菌株分别接种于高氏一号合成培养基、甘油天门冬素培养基、土豆琼脂培养基、酵母粉葡萄糖培养基、燕麦汁培养基，28℃培养7天，观察记录菌株气生菌丝、基生菌丝的颜色及有无可溶性色素产生。
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
如何在丝状放线菌中进行高通量筛选
如何在丝状放线菌中进行高通量筛选引言丝状放线菌是一类广泛分布在自然界中的细菌，具有丰富的次级代谢产物，如抗生素、抗肿瘤药物和其他活性物质，是重要的工业和医药微生物资源。
为了提高丝状放线菌的产物合成能力和多样性，需要对其进行基因工程改造，引入或调控相关的基因或代谢途径。
然而，由于丝状放线菌的基因组复杂、转化效率低、表达调控复杂等原因，传统的基因工程方法往往效率低下、耗时耗力。
因此，需要开发高通量筛选方法，快速寻找优良的菌株或基因，从而提高丝状放线菌的菌种改良和产物开发效率。
高通量筛选方法的概述高通量筛选是一种快速处理大量样品，并从中筛选出最佳候选者的方法。
在丝状放线菌中进行高通量筛选，主要有以下几个步骤：•菌株的构建：利用不同的基因编辑技术，如同源重组、CRISPR-Cas9等，对丝状放线菌的基因组进行改造，引入或敲除相关的基因或代谢途径。
•菌株的培养：利用不同的培养条件和诱导剂，对构建好的菌株进行培养，使其表达或合成目标产物。
•菌株的分析：利用不同的检测方法，如紫外吸收法、荧光法、色谱法等，对培养好的菌株进行分析，评估其产物的含量或活性。
•菌株的分选：利用不同的分选方法，如微孔板培养分析法、生物测定法、抗生素生存筛选法、荧光激活细胞分选法（FACS）、荧光激活液滴分选法（FADS）等，从大量的菌株中筛选出最佳的候选者。
高通量筛选方法的比较不同的高通量筛选方法有各自的特点和适用场景，以下对比了五种常用的高通量筛选方法：•微孔板培养分析法：这种方法是利用微孔板进行菌株的培养和产物的分析，可以同时处理多个样品，提高筛选效率。
微孔板的每个孔都可以作为一个微型反应器，可以加入不同的菌株、培养基和诱导剂，进行不同条件下的菌株培养。
培养结束后，可以利用不同的分析方法，如紫外吸收法、荧光法、色谱法等，对微孔板中的产物进行定性或定量的检测，从而评估菌株的产物含量或活性。
这种方法的优点是可以同时处理多个样品，节省时间和空间，且可以利用现有的仪器和耗材，无需特殊的设计和制作。
黄瓜灰霉病拮抗放线菌7-16的筛选及发酵条件优化
放 线 菌 产 生 的抗 生 素及 其 次 生 代 谢 产 物 在植 物 病 害 防 治 中具 有 重 要 的 作 用 。在 目前 已发 现 的 １０ ０多 种 微 生 物 来 源 ０
７０培养基 ３ 淀粉 ５０ 、 生饼 粉 ２５ 、 母粉 ００％ 、 ．； ： ．％ 花 ．％ 酵 ．８ 葡 萄 糖 ０ ０ ％ 、 Ｎ Ｏ ． ８ 、 ａ Ｏ ． ２ 、 ａ １ ．２ （ Ｈ ）Ｓ ０ ０ ％ Ｃ Ｃ ３０ ３ ％ Ｎ Ｃ
一
１４ 一 １
江苏农业科学
２１ ０ １年第 ３ ９卷第 ４期
关 丽杰 ， 国梁 ， 谭 杨 迪 ， 等．黄 瓜 灰 霉病 拮 抗 放 线 菌 ７—１ ６的 筛选 及 发 酵 条 件 优 化 ［ ］ Ｊ ．江 苏 农 业 科 学 ，０ １３ （ ：１ ２ １ ，９ ４） １４—１６ １
黄 瓜 灰霉 病 拮 抗 放 线 菌 ７一ｌ ６的筛 选 及 发 酵 条 件优 化
分别 调 至 ３０、． ５ ０ ６ ０、． 、． 、 ． ， 最 佳 发 酵 温 度 ． ４ ０、． 、． ７ ０ ８ ０ ９ ０ 在
基 。 （ ） 酵 时 问 对 抑 菌活 性 的影 响 ： 基 础 培 养 基 ｐ 值 凋 １发 将 Ｈ
为 ７ ０ 装 样 量 为 ４ （ ５ Ｌ三 角 瓶 ）２ １０ｒｍ ｎ分 ．， ０ｍＬ ２ ０ｍ ，８ｏ ５ ｉ Ｃ、 ／ 别 发 酵 培 养 ２ ３４、 、 ７、 ｄ 生 物 测 定 确 定 最 佳 发 酵 时 间 。 、 、 ５６、 ８ ， （ ） 酵 温 度 对 抑 菌 活 性 的 影 响 ： 基 础 培 养 基 ｐ 值 调 为 ２发 将 Ｈ ７ ０ 装 样 量 为 ４ Ｌ ２ ０ｍＬ三 角 瓶 ）分 别 于 ２ 、４ ２ 、２ ．， ０ｍ （５ ， ０ ２ 、８ ３ 、 ３ 、０℃温 度 下 培 养 ，５ ｍ ｎ发酵 ４ｄ ， 物 测定 确 定 最 ６４ １０ｒ ｉ ／ 后 生 佳 发 酵 温度 。 （ ） 始 ｐ 对 抑 菌 活 性 的 影 响 ： 装 样 量 为 ３初 Ｈ 在 ４ Ｌ ２ ０ｍ ０ｍ （ ５ Ｌ三 角 瓶 ） 条 件 下 ， 基 础 培 养 基 初 始 ｐ 值 的 将 Ｈ
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
产木聚糖酶放线菌的筛选
１１ 斜 面培 养基 ．２ ． 玉 米 芯木 聚糖 １ ％，土豆 ２ ％，琼脂 ２ ． ０ ０ ％。 １ ． 发 酵培养基 ．３ １ 玉 米 木 聚 糖 １ ％ ， 酵 母 浸 膏 ０５ ，蛋 白 ． ５ ．％
胨 １ ％，Ｋ Ｐ ４ ．５ ，ＫＨＰ ４ ． ％，ＭｇＯ ・Ｈ Ｏ Ｈ２Ｏ ７ ％ ０ ２ Ｏ １ ０ ５ Ｓ ４７ ２
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第 １ 期（ １ 总第 １ ８ ） 】期 ２０ ０ ７年 １ 月 １
农产 品 加 学 刊 】 ・
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放线菌的分离和鉴定
放线菌的分离和鉴定放线菌的分离和鉴定实验器材：1.⼟壤材料 5 ---10cm 处⼟壤，放于采集袋中带回实验室。
2.培养基淀粉琼脂培养基（⾼⽒Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% ⽢油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% ⼄醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成⾰兰⽒染液3( 1) 结晶紫染⾊液: 甲液结晶紫2g，95% ⼄醇20ml;⼄液草酸铵0. 8g，蒸馏⽔80ml。
甲⼄液先分别溶解，然后混合在⼀起，过滤除去残渣后装⼊滴瓶中备⽤。
( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏⽔100ml 先取少量蒸馏⽔加⼊碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加⼊全部蒸馏⽔，分装于滴瓶中备⽤。
( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%⼄醇100ml，溶解装⼊滴瓶备⽤。
4.仪器和其他⽤品⽆菌纸、带玻璃珠的三⾓烧瓶、1ml⽆菌吸管、⽆菌试管、⽆菌培养⽫⼀.⽬的要求：1. 掌握倒平板的⽅法和常⽤分离纯化微⽣物的基本操作。
2. 初步观察⼟壤中放线菌菌落形态。
3. 初步了解掌握微⽣物分类的基本⽅法。
⼆.实验原理：放线菌在⾃然界中主要⽣存于陆地和淡⽔中，⼟壤为这类微⽣物的主要习居场所，⽆论在种类和数量上都⽐其他地⽅繁多。
在中性或偏碱性的⼟壤和有机质等丰富的⼟壤中较多。
放线菌以孢⼦和菌丝⽚段的形式存在于⼟壤，每克⼟壤内含有数万、数⼗万的孢⼦。
放线菌的⽣活史和形态特征放线菌的孢⼦和孢囊孢⼦在适宜的环境下吸收⽔分，膨胀萌发，⽣出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。
因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体⼀般没有横隔，由于菌丝体长⼊培养基内和培养基表⾯，并纠缠在⼀起形成密集的菌落，所以⽤接种针将整个菌落培养基挑起⽽不破裂。
抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG—3A1鉴定
抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG—3A1鉴定1材料与方法1.1材料1.1.1病原菌尖孢镰刀菌4号生理小种，由中国热带农业科学院生物技术研究所曾会才实验室提供。
1.1.2主要培养基内生放线菌分离培养基采用改良高氏（Gauses）1号培养基（GS）、1/10 ATCC 合成培养基、葡萄糖天门冬酸培养基（GA）、腐殖酸培养基（HV）、改良高氏2号培养基（GPT）和改良淀粉酪素培养基（SIM）[14-18]，为抑制杂菌生长，在各分离培养基中均加入终浓度为75 mg/L的重铬酸钾、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸；放线菌纯化培养保存采用YE培养基；抑菌试验采用马铃薯琼脂培养基（PDA）；液体发酵采用淀粉-大豆粉液体培养基；形态特征观察采用国际链霉菌计划（ISP）推荐的培养基，参考Shirling等的方法[19-20 ]进行配制。
1.1.3样品采集与处理2012年11月3日从海南省临高南宝蕉园（19°47′1″N，109°51′17″E）和皇桐蕉园（19°49′58″N，109°50″E）采集香蕉植株样品（表1）。
每个品种随机采集香蕉植株10株，混匀。
表1样品采集信息采集地点根部土壤pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美台蕉园4.35农科健康植株（NK）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17南天健康植株（NJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54南天感病植株（NB）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17巴西健康植株（BJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54巴西感病植株（BB）根、球茎、假茎、叶1.2方法1.2.1内生放线菌的分离参考阮继生分离弗兰克氏菌的方法对样品进行表面消毒，采用组织块匀浆法进行内生放线菌分离。
1.2.2香蕉枯萎病内生拮抗放线菌筛选以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，采用平板对峙法进行初筛；对初筛有活性的菌株用平板对峙法进行复筛，计算抑菌率，公式为：抑菌率=[（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径]×100%。
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放线菌筛选的一般方法
摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。
放线菌是革兰氏阳性细菌。
因菌落呈放线状而的得名。
常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
关键词：放线菌筛选微生物
1 放线菌的情况
放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。
因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。
大多数有发达的分枝菌丝。
菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约～1微米。
可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。
是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。
放线菌因菌落呈放线状而的得名。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。
一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。
弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。
此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。
少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。
因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。
放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。
放线菌只是
形态上的分类，属于细菌界放线菌门。
土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。
它是一个原核生物类群，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。
与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。
2 放线菌的培养基
高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。
这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3、NaCl 、K 2HPO 43H 2O 、MgSO 47H2O 作为无机盐，FeSO47H2O 作为微生物的微量
元素，提供铁离子等组成。
高氏一号合成培养基需要K 2HPO 43H 2O ，可溶性淀粉5g ，硝酸钾,MgSO 47H2O ，
FeSO 47H 2O ，氯化钠，琼脂5g ，水250ml 。
配制时，先依次加入上述药品（除琼脂
外）顺序溶解，加入无菌水至250ml ，调节pH ＝，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。
3 土壤中放线菌的分离
编号，分装 取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。
每个稀释度做两个培养皿。
然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml 左右，待冷凝成平板。
另取5支盛有9ml 一只盛有10ml 无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释倾注分离 称1g 土样放入10ml 无菌水试管中振荡10min ，即10-1的土壤悬液，静置30s 。
用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml 并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。
即为10-2浓度的土壤稀释液。
依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释
度换1支无菌吸管）。
4 倒平板分离培养
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。
（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。
）
用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。
用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。
5 培养
接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。
6 菌种纯化
倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。
平板划线划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
7 进一步鉴定
用接种铲将平板上的菌苔连同培养基切下一小方块（宽2-3mm），菌面朝上放在载玻片上，另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气生菌丝、孢子丝和孢子）粘附（“印”）在载玻片的中央，将有印记的一面朝上，火焰固定，染色（1min），水洗，干燥，油镜观察。
8 确定放线菌
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