放线菌的分离与筛选方法
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
放线菌的选择分离培养
3,培养
平板倒置于 28℃培养箱中培养7天,观察菌落的生长情况,菌落特征.
�
1 ,取样
三 ,操作步骤
2, 制备土壤稀释液
3, 倾注平板
4,培养
四,实验操作内容
每组所需材料:
土样,装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶1瓶,9ml无菌水两支, 1或2ml移 液管2支,2副培养皿,60ml高氏1号培养基1瓶.
实验步骤
1,制备土壤稀释液 取土样0.5g,土样热处理后,加入装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中, 室温下手摇振荡10分钟,静止5分钟,用移液管取上清液1ml(10-2)加入到9ml 无菌水稀释到10-3,同样操作稀释到10-4.注意回收玻璃珠. 用移液管分别吸取10-2原液和10-4稀释液各0.5ml于标志稀释倍数的平板上 ( 10-2原液1个平行, 10-4稀释液1个平行).
二,平板分离法
A 平板划线分离法 B 倾注平板法 C 稀释涂布平板法
1)放线菌分离常用基础培养基 2)选择性培养基
选择培养基的设计
如:高氏一号琼脂;精氨酸-甘油琼脂;葡萄糖-天冬酰胺琼脂.
a,为抑制细菌及霉菌的生长,可加入链霉素(抑制细菌)和制霉素等. b,加入重铬酸钾可同时抑制细菌和霉菌的生长;对放线菌生长无抑制作用 .
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"生命科学导论"实验
放线菌的选择分离培养
一,放线菌的选择分离培养
1 ,目的要求
从土壤中分离纯化放线菌,初步掌握微生物的土壤中放线菌最丰富,品种齐全.从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣 中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和 嗜酸性的菌种. 土壤中含有丰富的放线菌,主要是链霉菌.而链霉菌以外的其他放线 菌,如小单孢菌,游动放线菌,诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要 的产生菌.但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法 很难得到. 对样品进行风干,干热处理,培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真 菌的数量;用干热和苯酚处理减少链霉菌数量的方法,可以分离得到更 多种类的放线菌.
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
土壤中放线菌的分离
土壤中放线菌的分离
分离土壤中的放线菌的步骤如下：
1. 准备培养基：选择适合放线菌生长的培养基，常用的包括土壤提取物富集培养基、葡萄糖琼脂糖培养基、镜菌素琼脂糖培养基等。
2. 取样：在选择好的采样地点，使用消毒的工具（如消毒棉签或无菌铲子）采集土壤样品。
注意避免土壤样品的污染。
3. 预处理：将采集到的土壤样品放入无菌研钵中，加入合适的无菌生理盐水或者缓冲液，悬浮土壤样品，使放线菌被更好地释放出来。
可以对土壤样品进行稀释处理，以降低微生物密度。
4. 稀释平板法：将预处理好的土壤样品用无菌移液管分别
在培养基平板上均匀涂布。
然后放入恒温培养箱进行培养。
孵育时间一般为3-4周。
在培养箱内，放线菌会产生菌落
形成。
5. 单菌分离：在培养箱内观察到单个的放线菌菌落后，使
用消毒的工具将其分离到新的培养基上，形成纯种菌落。
这一步可以采用传统的传代分离法或微量分离法。
6. 纯种菌株保存：将得到的纯种菌株存储在适当的冻存管中，通过冻存进行长期保存。
需要注意的是，在进行上述步骤时，需要严格遵守无菌操
作的原则，避免样品或培养基的污染，以保证得到纯种的
放线菌菌株。
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。
它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。
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以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。
将培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。
然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。
培养基上会出现微生物菌落。
霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。
放线菌的分离和鉴定
放线菌的分离和鉴定放线菌的分离和鉴定实验器材：1.⼟壤材料 5 ---10cm 处⼟壤，放于采集袋中带回实验室。
2.培养基淀粉琼脂培养基（⾼⽒Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% ⽢油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% ⼄醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成⾰兰⽒染液3( 1) 结晶紫染⾊液: 甲液结晶紫2g，95% ⼄醇20ml;⼄液草酸铵0. 8g，蒸馏⽔80ml。
甲⼄液先分别溶解，然后混合在⼀起，过滤除去残渣后装⼊滴瓶中备⽤。
( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏⽔100ml 先取少量蒸馏⽔加⼊碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加⼊全部蒸馏⽔，分装于滴瓶中备⽤。
( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%⼄醇100ml，溶解装⼊滴瓶备⽤。
4.仪器和其他⽤品⽆菌纸、带玻璃珠的三⾓烧瓶、1ml⽆菌吸管、⽆菌试管、⽆菌培养⽫⼀.⽬的要求：1. 掌握倒平板的⽅法和常⽤分离纯化微⽣物的基本操作。
2. 初步观察⼟壤中放线菌菌落形态。
3. 初步了解掌握微⽣物分类的基本⽅法。
⼆.实验原理：放线菌在⾃然界中主要⽣存于陆地和淡⽔中，⼟壤为这类微⽣物的主要习居场所，⽆论在种类和数量上都⽐其他地⽅繁多。
在中性或偏碱性的⼟壤和有机质等丰富的⼟壤中较多。
放线菌以孢⼦和菌丝⽚段的形式存在于⼟壤，每克⼟壤内含有数万、数⼗万的孢⼦。
放线菌的⽣活史和形态特征放线菌的孢⼦和孢囊孢⼦在适宜的环境下吸收⽔分，膨胀萌发，⽣出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。
因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体⼀般没有横隔，由于菌丝体长⼊培养基内和培养基表⾯，并纠缠在⼀起形成密集的菌落，所以⽤接种针将整个菌落培养基挑起⽽不破裂。
稀有放线菌的分离及抗菌筛选
ｄ ｆ ｒ ｎ ｒ ｔ ａ ｍｅ ｔｔ ｈ ｏｌｓ ｍｐ ｅ ｎ ａ ｉ ｇ ｉｈ ｂ ｔ ｒｏ ｏ ． ｈ ｌ ｆ ａ ｅ ｉ ｕ ｉｎ ｉ ｕ ｅ ｏ ｍｅ ｓ ｒ ｈ ｉ ｅ ｅ ｔｐ ｅｒ ｔ ｎ ｔ ｅ ｓ ｉ ａ ｌｓ ａ ｄ ｈ ｖｎ ｎ ｉ ｉ ｒｎ ｔ Ｔ ｅ ｓｉ ｏ ｐ ｒｄ ｆ ｓｏ ｓ ｓ ｄ ｔ ａ ｕ ｅ ｔ ｅ ｅ ｏ ｏ ｐ ｐ ｆ
放线菌分离培养基筛选及杂菌课件
结 果 与 分 析
Elements Page
参 考 文 献
1. 培养基制备: 分别按A, B, C, D, E, F, G, H 8 种培养基成分称量, 配制好后1 × 105Pa 30min 灭菌, 冷却至50 ℃ ~ 60 ℃ 按不同处理加入抑制剂倒平板备用。 2 .土样中放线菌分离: 稀释平板涂抹法分离, 28 ℃ 培养7d。
培养基种类对放线菌分离计数结果的影响
放线菌是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物。目前从微生物中发现的 8, 000多种微生物活性物质中, 有近70% 是放线菌产生的 。但是, 放线菌仅占土壤中所有放线菌的10% 左右 。开展大规模放线菌资源调查和建立有效 的放线菌分离方法是发现放线菌新种属和新活性物质产生菌的重要途径之一。现有的 放线菌分离培养基多达30 余种 , 放线菌资源调查待分离土样数量很大, 培养基种类 过多将加大分离工作量, 故筛选几种出菌率高、能将土壤中绝大多数种类放线菌分离培养出的代表性培养基,可在保证获得绝大部分放线菌资源信息的情况下, 有效减少工作量。
材 料
1 .土壤样品: 采自青海省不同肥力的农田土壤, 1、2、3 号土样分别代表低、中、高有机质土。土样基本性质见表1。
2.培养基 A 高氏1 号琼脂培养基 B 黄豆粉琼脂培养基 C 秸秆腐解物琼脂培养基 D 泥炭浸汁琼脂培养基 E 土壤浸汁琼脂培养基 F 燕麦片琼脂培养基 G 腐殖酸琼脂培养基 H 小麦粉琼脂培养基
研 究 Байду номын сангаас 的
放线菌最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中，泥土所特有的“泥腥味”就是由放线菌产生的。它们中绝大多数是腐生菌，能将动植物的尸体腐烂、“吃”光，然后转化成有利于植物生长的营养物质，在自然界物质循环中立下了不朽的功勋。还有一类叫弗兰克氏菌的放线菌，生长在许多豆科植物的根瘤里，能固定大气中的氮，成为植物能利用的氮肥。除了生产抗生素外，放线菌在工业上还有许多其他贡献。例如，利用放线菌还可以生产维生素B12、－胡萝卜素等维生素，生产蛋白酶、溶菌酶，以及用于生产高果糖浆的葡萄糖异构酶等酶制剂。另外，放线菌在石油工业和污水处理等方面也可发挥一技之长。 虽然少数寄生性的放线菌会引起人和动植物病害，有些放线菌会使食物变质，或者对棉毛织品和纸张造成破坏，对人类有害，但这些比起放线菌的功绩来，实在是微不足道的。
土壤中放线菌的分离 (2)
土壤中放线菌的分离简介放线菌（Actinomycetes）是一类广泛存在于地球各种土壤中的微生物，具有丰富的生物活性代谢产物和生物学功能。
分离土壤中的放线菌对于获得新的生物活性物质和解析放线菌菌株有着重要意义。
本文将介绍土壤中放线菌的分离方法及过程，并提供一些实践经验。
分离方法样品收集选择合适的样品收集地点至关重要。
一般情况下，草地、农田、果园等土壤中含有较丰富的放线菌资源。
在进行样品收集前，应先清理收集工具和容器，并使用无菌绳固定收集区域，避免外界杂质污染。
样品处理1.从采集的土壤中取得样品，并将其放入无菌锥形瓶中。
2.将样品添加至无菌水中，形成土壤悬浮液。
可以通过搅拌或振荡等方式充分悬浮土壤颗粒。
3.通过离心的方法，去除悬浮液中的大颗粒和杂质。
分离培养基的制备分离出放线菌的选择培养基非常重要，一般常用的培养基有：•考马斯琼脂培养基（Koj A）•聚芽孢杆菌琼脂培养基（SGA）•苯丁三唑糖脂琼脂培养基（BIS）其中，考马斯琼脂培养基是最为常用的一种，可以选择性地培养出放线菌。
分离操作1.在无菌条件下，将处理好的土壤悬浮液均匀涂布于分离培养基上。
2.用一次性平皿、玻璃块或玻璃棍等工具均匀划开土壤悬浮液，以增加放线菌的分离点。
3.培养皿密封后，放入恒温培养箱进行培养，通常在28-30℃下培养7-10天。
鉴定和筛选在培养箱中培养的结果显示出放线菌的单独菌落后，可以进行以下鉴定和筛选步骤：1.观察和记录菌落形态特征，包括颜色、形状、质地等。
2.进行显微镜下的形态观察，例如菌丝形态、芽孢形态等。
3.进行生理生化特性的鉴定，包括酶活性、产生代谢产物等。
4.进行16S rRNA或其它分子生物学方法的鉴定，以确定放线菌属别。
实践经验1.分离培养基的配制需要细心严谨，避免污染。
最好在无菌工作台环境下操作。
2.鉴定放线菌时，不同菌株之间可能存在形态和生理差异，需要谨慎观察和鉴定。
3.放线菌培养需要一定的时间，早期菌落的筛选和鉴定需耐心等待。
海洋放线菌的培养鉴定与分离方法
海洋放线菌的培养鉴定与分离方法培养方法：1.海水培养基：海洋放线菌适应于富含海洋盐分的培养基。
一般的海水培养基包括海水、海营养盐、葡萄糖等成分。
2.杀菌处理：将培养基加热至沸腾，常温下过滤，或使用其他杀菌方法，如过滤器、紫外线照射等，以确保培养基无菌。
3.接种：将海洋样品（如海水、海洋沉积物等）加入到培养基中，翻腾混匀。
4.培养条件：通常在28-30℃下培养，选用适当的培养时间和转速，类似陆生放线菌的培养条件。
鉴定方法：1.形态学特征分析：观察海洋放线菌的形态特点，如菌落形态、颜色、边缘、透明度等。
2.生理生化特性检测：通过检测海洋放线菌的生理生化特征，如产生酸、氧化还原反应、产生酶、糖水解等。
3.生长特性分析：测定海洋放线菌的生长曲线、最适生长温度、最适生长pH等。
4.分子生物学鉴定：利用分子生物学技术，如16SrRNA序列分析、DNA-DNA杂交、脱氧核糖核酸酶电泳等，对海洋放线菌进行鉴定。
分离方法：1.稀释平板法：将海洋样品连续稀释后，取适量的稀释液均匀涂布于固体培养基平板上，在适当的温度下培养，待菌落形成后，进行分离和鉴定。
2.琼脂块分离法：将海洋样品均匀涂布于琼脂块上，培养至菌落形成后，将菌落分离，获得单菌落。
3.过滤法：将海洋样品过滤后，将过滤膜放置在含有适宜营养物质的培养基上，培养至菌落形成，进一步分离和鉴定。
4.琼脂滴定法：将海洋样品加入到含有适宜营养物质的琼脂液中，混合均匀后，滴定在含有固体琼脂的平板上，培养待菌落形成后，进行分离和鉴定。
总结：海洋放线菌的培养鉴定与分离方法主要包括培养基的选择、杀菌处理、接种、培养条件的确定等方面。
鉴定方法可以通过形态学特征分析、生理生化特性检测、生长特性分析和分子生物学鉴定等技术。
分离方法可以采用稀释平板法、琼脂块分离法、过滤法和琼脂滴定法等。
这些方法可以帮助研究人员获得纯培养的海洋放线菌菌种，为进一步的研究和利用奠定基础。
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放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：
1.1平板划线法：
待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法
将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：
主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测
发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有
无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.
2.1培养基；
2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）
3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基
2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速
度迅速。
重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可
显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。
2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形
杆菌
2.4放线菌分离与筛选
2.4.1传统的分离筛选思路；
以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选
产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。
初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。
优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。
缺点：方法粗放，
浪费很多初始条件下不显示活性的菌种。
复筛：对初筛的阳性菌株进一步改进，便于有效筛选出针对靶标的菌株。
2.4.2样品（土壤）处理：风干或加热是在杂菌抑制中较常见预处理方法。
室温风干处理得到的放线菌种类和数量均高于加热处理。
室温风干10d和20d放线菌数量无明显变化。
2.4.3放线菌分离与纯化
无菌条件下取1.0g风干土壤样品置于99mL/150mL三角瓶中（有时加入10-15滴10℅苯酚），振荡20-30min，然后将悬液梯度稀释至10-6，取0.1mL梯度液涂布于含重铬酸钾培养基上，28℃ 5-7d，挑选生长快的不同的菌落进行划线分离纯化（镜检）至纯培养物，转接于斜面保存（甘油法 -20℃冷冻保藏）。
附：放线菌菌落硬度大，干燥致密与基质结合紧密，不易挑取。
培养箱中放置一杯水以增加湿度，平板相对厚些，避免过找干涸。
如将材料干燥。
高温。
低温处理并改变培养温度和培养基成分，得到不同放线菌。
2.4.4筛选（拮抗试验）：
2.4.4.1初筛：
牛津杯法：24h摇瓶靶细菌悬浮液均匀涂布于平板，中央放置牛津杯，在牛津杯（内径6mm，外径8mm）中分别加试验菌发酵液0.15mL和无菌发酵液0.15mL，30℃ 2-3d，观察是否有抑菌圈产生，并测抑菌圈的直径，阴性对照：无菌水。
对峙培养法（初筛）：PDA平板以圆点为中心划一条直线，中心点接放线菌培养3d后，直线的两端距中心相同距离接同一病原菌。
培养一定时间，是否有抑菌圈产生，有抑菌圈的测量抑菌圈的相对半径（抑菌圈的半径—放线菌菌落半径），选择拮抗好的放线菌进入复筛。
琼脂扩散法（初筛）：分离纯化种接种到改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃ 7-8d，用打孔器打成直径5mm琼脂块。
取指示菌0.1mL涂布于普通琼脂平板，挑取琼脂块反贴到指示菌平板上，（鳗弧菌肠型点状气单胞菌28℃培养，大肠和金黄葡萄糖球菌37℃培养，24h后）观察抑菌圈和测量。
2.4.4.2复筛：将初筛有较强抗菌作用的放线菌株接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃ 140r/min 7-8d。
取指示菌0.05mL涂布于普通琼脂平板上，用灭菌的打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05mL注入孔中，培养24-48h后进行抑菌观察和测量。
2.4.5初步鉴定：
2.4.5.1菌落特征和形体特征
接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 5 7 10 15d，取出插片进行观察，气生基内菌丝以及是否产生横隔断裂等特征，并观察它们的生长情况，气生和基内菌丝颜色，作为分类的依据。
2.4.5.2生理生化试验：
进行明胶液化牛奶凝固和胨化硝酸盐还原淀粉水解硫化氢产生等试验。
菌株明胶液化牛奶凝固牛奶胨化硝酸盐还原淀粉水解硫化氢产生1. + + + + - -
2. + + - - + -
3. + + - + + -
4. + - + - + -
5. + - - + + +
6. + - - + + +。