放线菌筛选的一般方法
拮抗香蕉枯萎病放线菌的筛选与AM2041菌株的鉴定
拮抗香蕉枯萎病放线菌的筛选与AM2041菌株的鉴定本实验从海南各地采集土壤样本，从中筛选出具有对foc4拮抗作用明显的1株放线菌，并对其进行形态、生理生化、16s rdna序列及系统发育分析等方面的监督。
一、材料与方法1.供试菌株的分离菌株的分离采用高氏一号合成培养基。
在海南省海口、儋州、临高等地的8个香蕉种植园，选择香蕉枯萎病发病症状明显的香蕉树，在根系地表采集约20g土壤作为样本。
样本去除大块固体，放置在通风橱中风干10天。
每个样本称取1g，加入9ml无菌水，28℃、200r/min摇床上恒温培养一天，制成悬浮液。
静置1h后分别取上清100μl，进行101、102、103、104梯度的稀释。
稀释液分别取100μl进行涂板，每瓶重复3次。
培养皿28℃培养3天，挑取单菌落于平板上进行划线纯化，5天后进行观察。
2.拮抗菌株的筛选以本实验室所保存的菌液浓度约为109个/ml的foc4培养液作为检测样本，以琼脂挖块法进行初筛：pda平板上接种foc4培养液0.1ml,涂布均匀。
将分离得到的单菌落接种到新的pda平板上，28℃恒温培育2天，用5mm孔径的打孔器打孔，挑取带菌琼脂块放置于有foc4培养液涂布的pda平板上，每个菌株重复3次，28℃恒温培养36小时。
观察抑菌圈的情况。
筛选出的抗性作用明显且生长状况良好的菌株进行复筛。
将抗性菌株接种于snb培养液[11]中进行发酵，28℃、200 r/min摇床上恒温培养一天，室温静置1小时。
在pda平板上均匀涂布0.1ml foc4培养液后，将无菌的直径5mm滤纸贴在平板上。
取10μl抗性菌株的发酵液上清滴于滤纸中心，每个菌株重复3次，28℃培养1天。
观察菌落生长状况。
3.抗性菌株的分类鉴定形态学鉴定：将选出的抗性菌株分别接种于高氏一号合成培养基、甘油天门冬素培养基、土豆琼脂培养基、酵母粉葡萄糖培养基、燕麦汁培养基，28℃培养7天，观察记录菌株气生菌丝、基生菌丝的颜色及有无可溶性色素产生。
一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定
一株拮抗放线菌菌株的筛选与鉴定郭春燕;王旭正;刘少杰;于金凤【摘要】采用平板对峙法与灰色关联度分析法从小麦和苹果根际土壤中筛选出对小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)和小麦根腐病(Bipolaris sorokiniana)具有良好拮抗作用的放线菌,并依据菌落形态和培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等进行鉴定.结果表明,菌株FX-H-51抑菌效果显著,对不利生长环境有良好的耐受性.形态学与分子鉴定结果表明,菌株FX-H-51为海棠链霉菌(Streptomyces spectabilis).%Actinomycetes with strong antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana were screened out from wheat and apple rhizosphere soil by plate confrontation method and grey correlation degree analysis. They were identified according to the colony morphology and culture characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. The results showed that the FX-H-51 strain had significant antibacterial effect and better tolerance to the unfavorable growth environment. The morphological and molecular identification results indicated that the FX-H-51 strain was to Streptomyces spectabilis.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)004【总页数】5页(P43-47)【关键词】放线菌;灰色关联度分析;拮抗活性;海棠链霉菌【作者】郭春燕;王旭正;刘少杰;于金凤【作者单位】山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018;山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018;山东省烟台农业学校,山东烟台265100;山东农业大学植保学院植物病理学系,山东泰安 271018【正文语种】中文【中图分类】S154.3放线菌是陆生性较强的原核生物，同时也是一类具有重要经济价值和生物研究价值的微生物资源，其中链霉菌属(Steptomyces)的放线菌在植物病害生物防治中已有较多的研究报道。
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
如何在丝状放线菌中进行高通量筛选
如何在丝状放线菌中进行高通量筛选引言丝状放线菌是一类广泛分布在自然界中的细菌，具有丰富的次级代谢产物，如抗生素、抗肿瘤药物和其他活性物质，是重要的工业和医药微生物资源。
为了提高丝状放线菌的产物合成能力和多样性，需要对其进行基因工程改造，引入或调控相关的基因或代谢途径。
然而，由于丝状放线菌的基因组复杂、转化效率低、表达调控复杂等原因，传统的基因工程方法往往效率低下、耗时耗力。
因此，需要开发高通量筛选方法，快速寻找优良的菌株或基因，从而提高丝状放线菌的菌种改良和产物开发效率。
高通量筛选方法的概述高通量筛选是一种快速处理大量样品，并从中筛选出最佳候选者的方法。
在丝状放线菌中进行高通量筛选，主要有以下几个步骤：•菌株的构建：利用不同的基因编辑技术，如同源重组、CRISPR-Cas9等，对丝状放线菌的基因组进行改造，引入或敲除相关的基因或代谢途径。
•菌株的培养：利用不同的培养条件和诱导剂，对构建好的菌株进行培养，使其表达或合成目标产物。
•菌株的分析：利用不同的检测方法，如紫外吸收法、荧光法、色谱法等，对培养好的菌株进行分析，评估其产物的含量或活性。
•菌株的分选：利用不同的分选方法，如微孔板培养分析法、生物测定法、抗生素生存筛选法、荧光激活细胞分选法（FACS）、荧光激活液滴分选法（FADS）等，从大量的菌株中筛选出最佳的候选者。
高通量筛选方法的比较不同的高通量筛选方法有各自的特点和适用场景，以下对比了五种常用的高通量筛选方法：•微孔板培养分析法：这种方法是利用微孔板进行菌株的培养和产物的分析，可以同时处理多个样品，提高筛选效率。
微孔板的每个孔都可以作为一个微型反应器，可以加入不同的菌株、培养基和诱导剂，进行不同条件下的菌株培养。
培养结束后，可以利用不同的分析方法，如紫外吸收法、荧光法、色谱法等，对微孔板中的产物进行定性或定量的检测，从而评估菌株的产物含量或活性。
这种方法的优点是可以同时处理多个样品，节省时间和空间，且可以利用现有的仪器和耗材，无需特殊的设计和制作。
菌种选育
菌种的营养特征独特
生长特征独特
选择性分离
无选择性特征
根据产物的特征进行
随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，
从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理
控制营养成分
控制培养基酸碱度
添加抑制剂
控制培养温度
控制通气条件
选择性分离技术
施加选择压力，进行定向筛选
个平板上铺上一种试验菌。
A.富集液体培养
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术
技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株
生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件
培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μ max）筛 选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等 问题
连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素；
使用一聚合或复合形式的生长限制养分；
避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物
阻遏；
确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
培养基中加入新生霉素(25µ g/mL)和亚胺环己酮(50 µ g/mL)
能分离出普通高温放线菌。
菌种的培养
温度和时间两方面，主要变量为时间。
培养温度：放线菌25～30oC，嗜热菌45～55oC，嗜冷 菌4～10oC。 培养时间： 是培养的主要变量，嗜温菌（链霉菌和 小单孢菌）7～14d；嗜热菌（高温放线菌）1～2d。
烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选及鉴定
Ａ ｇ ｉ ｒ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ １ ９ ３ ， Ｃ ｉｎ ｈ ａ ； ４ ． Ｃ ｉ ｔ ｙ Ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｍａ ｎ ａ ｇ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｘ ｉ ｎｙ ａ ａ ｎ ｇ ， Ｘｉ ａ ｎ ｙ ｎｇ ａ ， Ｓ ｈ ｎｘ ａ ｉ ７ １ ２ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ５
中国烟草科学
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｃ ｏ Ｓ ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ
２ ０ １ ３ ０ ４ ， ３ ４ （ ２）
烟草青枯茵拮抗放线菌 的筛选及鉴定
陆铮铮 ， 一 ，彭丽娟 １ ， ２ 丁海霞 ，左 希 ，彭 杰 ，蒋选利 ’
（ １ ． 贵州大学贵州 山地农业病虫害重点 实验 室 ，贵 阳 ５ ５ ０ ０ ２ ５ ；２ ． 贵州大学农学院 ，贵阳 ５ ５ ０ ０ ２ ５ ；３ ． 中国农业大学农 学与生 物技术学院 ，北京 １ ０ ０ １ ９ ３ ；４ ． 咸阳市城 市绿化管理处 ，陕西 咸 阳 ７ １ ２ ０ ０ ０ ；５ ． 天柱县烟草专卖局 ，贵州 天柱 ５ ５ ６ ６ ０ ０）
链 霉 菌平 均抑 菌 圈直 径 为 ２ ０ ． ３ ４ ｍ ｍ。
关键词 ：烟草；青枯病 ；生物防治；放线菌 中图分类号 ： ￥ ５ ７ ２ ． ０ ８ 文章编号 ：１ ０ ０ ７ — ５ １ １ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ — ０ ０ ５ ４ — ０ ５ ＤＯ Ｉ ： １ ０ ． ３ ０ ７ — ５ １ １ ９ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ２ ． ０ １ ２
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｆｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｏ ｎ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ｏ ｍｙ ｃ ｅ ｔ ｅ ｓ ａ ｇ ｉｎ ａ ｓ ｔ Ｒ ａ ｌ ｓ ｔ ｏ ｎ ｉ ａ ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ａ ｃ ｅ ａ ｒ ｕ ｍ，ｗｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ５ ６ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ
酱香白酒酿造过程放线菌的筛选与风味研究
酱香白酒酿造过程放线菌的筛选与风味研究酱香型白酒酿造历史悠久,工艺独特,开放式的固态发酵造就了复杂而又特殊的酿酒微生态系统,最终形成酱香型白酒独一无二的酒体风格。
酱香型白酒酿造体系微生态系统研究是科学认识酱香型白酒发酵中所蕴藏生物学问题的关键之一。
放线菌作为酱酒酿造中的主要微生物之一,既有风味特征作用又有微生态功能作用。
放线菌与产酱香功能细菌之间的微生态研究及风味影响机制分析,有利于深入研究酱香型白酒发酵机理,促进酱香型白酒进一步发展。
本研究从产异味的放线菌出发,以探究白色链霉菌亚种(Streptomyces albus subsp.)(编号A22)与产酱香功能解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(编号B6)发酵体系中风味影响机制为目的。
通过对产异味放线菌的筛选及鉴定、酿造环境胁迫条件耐受性、特征代谢产物以及对产酱香功能细菌特征代谢风味成分影响等方面进行了研究,取得了如下的结果:(1)通过对酱香型白酒酿造过程中放线菌初筛得到30株,再通过固态发酵感官闻香,筛选到一株产异味突出的菌株(编号A22),经多相分类鉴定为白色链霉菌亚种(Streptomyces albus subsp.)。
(2)对A22菌株进行主要酿造环境胁迫条件耐受性进行分析,结果表明:A22菌株能耐45℃高温、4%vol乙醇、pH4.0环境,其对主要酿造环境胁迫条件适应性较好。
(3)通过HS-SPME和GC-MS对B6、A22、A22B6固态发酵代谢产特征性风味成分进行定性定量分析,结果表明:A22代谢所产土臭素是发酵醅中异味的主要来源,为关键特征性成分;功能细菌B6代谢所产吡嗪类物质是酱酒中的健康功能成分,高温有利吡嗪类总量和种类的增加;混菌发酵时,B6抑制A22产土臭素,发酵醅异味得到调节,风味得到改善,正常酿造条件调节减少酒醅异味;混菌发酵时,A22抑制B6产吡嗪类总量,从风味角度来说A22对B6吡嗪代谢具有一定的调节作用。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
放线菌的分离
实验五：土壤中放线菌的分离实验学时：5学时实验类型：验证性实验、综合性实验实验要求：必修一、实验目的从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。
了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。
通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。
但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。
用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。
首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。
常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。
其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。
抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。
原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。
四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。
而得以快速分离纯化的目的。
如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。
在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。
如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。
实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。
原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。
B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。
首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。