放线菌筛选的一般方法定稿版
杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验
杀灭水产病源菌的放线菌筛选及放治试验从海洋或淡水体的污泥中分离水生放线菌，以鳗弧菌和肠型点状气单孢菌，这两种典型病害菌为指示菌，筛选杀菌放线菌，并初步鉴定。
1.指示菌：鳗弧菌和肠型点状气单孢菌中科院水生生物研究所提供大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验室保存种2.放线菌株分离纯化：从不同地区海洋或淡水体的污泥样品，取3g加入30mL无菌去离子水中，震荡20-30min，梯度稀释至10-2、10-3、10-4 ，涂布于高氏1号平板（培养基中加入0.0075℅重铬酸钾，抑制细菌和真菌），28℃培养7d.挑不同形态的单菌落到高氏1号斜面培养，将菌落在平板上反复划线纯化得纯培养物，4℃冰箱保存。
分离出86株淡水放线菌和77株海洋放线菌。
3.放线菌株的筛选：3.1初筛：将纯化菌株接种于改良黄豆粉琼脂培养基上，28℃培养8d.用无菌钻孔器打成5mm的琼脂块。
取指示菌0.1ml涂布于普通琼脂平板，挑取打好的放线菌琼脂块反贴到已涂指示菌的平板上，鳗弧菌和肠型点状气单孢菌在28℃培养，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37℃培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。
琼脂扩散法抑菌试验表明：19株淡水放线菌具有抑菌活性，32株海洋放线菌具有活性，故海洋放线菌产生抗菌物质比例高。
对初筛活性强的7株海洋和3株淡水放线菌加入复筛。
3.2复筛：有较强抗菌能力的放线菌接种于改良黄豆粉液体培养基中，28℃140r/min培养8d，取指示菌0.05ml涂布于普通琼脂平板，用无菌打孔器在培养基上打孔，取放线菌培养液0.05ml注入孔中，培养24h，进行抑菌圈的观察和测量。
获得较好的海洋放线菌4株，淡水放线菌2株，其抗菌活性测定结果表：六株放线菌抗菌活性测定结果（抑菌圈直径） mm鳗弧菌肠型点状大肠杆菌金黄色葡菌株产气单胞菌萄球菌1 18 17 15.5 19.52 18 18 16 183 15 15 16 184 10 8 -（无抗） 165 13 14 - 14.56 15 15 - 184.六株放线菌的初步鉴定：4.1形态和培养特征观察：分别接种于高氏1号培养基上，插片，28℃培养3 7 15 30d，取出插片，观察气生菌丝（包括颜色，是否产色素）基内菌丝（包括颜色，是否产色素）是否产生横隔断裂等特征，并观察它们的生长情况，取成熟期的特征作为分类依据。
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究
212 热处理对可培养放线菌和细菌数量的影响 在同样的处理时间下 , 随着预处理温度升高 , 放线菌数量和种类均明显增加 , 细
菌数量有减少趋势 , 说明通过一定温度预处理有利于放线菌孢子萌发 , 对细菌生长有 一定抑制作用 (表 3) 。如 1 号土样经 110h ×120 ℃处理后放线菌数量 (719 ×106 个Πg) 和种类 (18 种) 较 110h ×100 ℃处理的放线菌数量 (711 ×106 个Πg) 和种类 (15 种) 分 别增加了 10 %和 20 %。相同温度处理下 , 随着处理时间延长 , 放线菌数量和种类均呈 现先升高 、后降低的趋势 , 细菌数量稍有减少 。如 120 ℃下 , 1 号土经 110h , 115h 及 210h 处理后放线菌数量 ( ×106 个Πg) 分别为 719 、714 及 511 , 120 ℃×210h 处理下的放 线菌数量分别比 120 ℃×115h 和 120 ℃×110h 处理降低了 55 % 和 45 % , 即处理时间过 长会导致放线菌数量减少 。因此 , 在分离放线菌前 , 采用适当的温度和时间对土样进 行预处理可使放线菌孢子活化 , 以便获得更多放线菌 。但热处理对减少细菌的出菌量 效果不理想 , 其结果与姜成林[9] 的研究一致 。
2004 年 31 (2) 微 生 物 学 通 报
·61 ·
放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究
司美茹 薛泉宏 3 来航线
(西北农林科技大学资源环境学院 杨凌 712100)
摘要 : 采用平板涂抹分离法研究了培养基种类 、土壤样品加热预处理及化学抑制剂对放线菌分 离效果的影响 。结果表明 : 高氏 1 号琼脂培养基 ( GA) 和秸秆腐解物琼脂培养基 (SDSA) 的分 离结果可以反映土壤中放线菌的基本状况 ; 120 ℃×110h 加热预处理土样能促进放线菌孢子萌 发 , 增加放线菌的分离数量和种类 。供试土样经 120 ℃×110h 加热预处理后放线菌的数量和类 型较对照处理分别增加了 515 %～5419 %和 1215 %～100 % , 但加热处理对减少细菌数量作用不 明显 ; 在放线菌分离培养基中同时加入 K2 Cr2O775μgΠmL 与 1～3μgΠmL 青霉素 , 细菌数量减少 , 1 号土样在 SDSA 培养基上放线菌数量 ( ×106 个Πg) 和种类 (种) 分别较仅加入 75μgΠmL K2 Cr2O7 处理减少 0～5818 %和 0～1812 % ; 链霉素不能用作分离放线菌时的细菌抑制剂 。 关键词 : 放线菌 , 微生物资源 , 放线菌分离 , 培养基 中图分类号 : Q931331 文献标识码 : A 文章编号 : 025322654 (2004) 0220061205
放线菌的筛选
• 2.3菌株发酵滤液的拮抗性测定 选择初筛拮抗效果较好的放线菌进行液体发酵培养， 利用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定菌株 • 发酵滤液对不同病原菌的拮抗作用。 （1）发酵滤液的制备 将孢子浓度为108个/mL的放线菌接种到液体发酵培 养基中，于28℃，200 rpm/min摇床中恒温培养，5 d 后取发酵液于4500 rpm/min条件下离8min，上清液经 微孔滤膜过滤，得发酵滤液。 （2）抑制菌丝生长速率法测定滤液的拮抗作用 取1mL发酵滤液与9mL融化的PDA培养基充分混匀， 倒入无菌培养皿中制成带药平板。待培养基凝固后， 在板中央接入一直径为7 mm的病原菌菌饼（带有菌丝 的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加 1mL蒸馏水的PDA平板为对照。培养5d后，十字交叉 法测量供试病原菌菌落直径，通过下述公式计算抑制 率
• 1.4 主要仪器 BCD-265冰箱 FA2004N电子天平 pH S-3C酸度计 TGL-16G型高速台式离心机 YXQ-L31-400蒸汽灭菌锅 GRP-9050隔水式恒温培养箱 DL-CJ-2N高性能无菌实验台 HZQ-Q全温振荡器 QL-901旋涡混合器
• 2.方法 • 2.1土壤中放线菌的分离、纯化 • （1）土样的预处理 将采集到的土样自然风干，按1：10的比 例加入碳酸钙，28℃培养箱内放置5-7d。 • （2）土壤悬浮液的制备 研钵研磨预处理的土壤样品至颗粒均匀。 称取1g土样加入装有l0mL无菌水的试管中， 充分震荡10min，制成浓度为10-1的土壤稀 释液。吸取1mL上清液，加到装有9mL无菌 水的试管中震荡成10-2的稀释液。依照同种 方法制备浓度分别为10-3、10-4、10-5的土 壤稀释液。
• （3）管碟法测定滤液的拮抗作用 培养好的病原菌制成一定浓度的菌悬 液，与适量PDA培养基充分混匀，倒入 无菌培养皿内制成带菌平板。待培养基 凝固后，在板的中央放置1个牛津杯，加 入0.2mL发酵滤液，每个处理重复3次。 以加蒸馏水的PDA平板为对照。置28℃ 恒温箱中培养，5 d后利用十字交叉法测 量抑菌圈直径。 结合初筛及发酵滤液对病原菌的拮 抗试验，确定目的菌株。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
放线菌的选择分离培养
（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中 120℃干热处理1h。
（3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠 的三角瓶中，加入0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟， 静止5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍。同时另取土 样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。
实验一 放线菌的选择分离与计数
一 教学要求
放线菌有多种代谢产物，如抗生素，维生素、氨基酸、 蛋白质、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，很多产物在农业、 医疗、食品及国防等领域产生了巨大的效益。
本实验的目的在于学习从土壤等环境中分离放线菌
精选ppt
1
二 实验原理
土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链 霉菌以外的其他放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、 诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但 往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离 方法很难得到。对样品进行风干、干热处理、培养基 添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量；用干热 和苯酚处理减少链霉菌数量的方法，可以分离得到更 多种类的放线菌。
（2）注意在培养基中添加重铬酸钾适量
精选ppt
6
六 思考题
请设计一种分离稀有放线菌的实验方案
精选ppt
7
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
精选ppt
2
三 材料与器材
菜园土或林地土，自然风干，备用。 0.1％ 重铬酸钾溶液，1％ 苯酚，高氏1号
培养基。 水浴锅等。
精选ppt
3
四 操作步骤
取样及预处理
1、来源：土壤中放线菌最丰富，品种齐全。可以筛选新的放线菌。 从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线 菌，从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
放线菌的筛选-分子
放线菌的筛选、分离与鉴定姓名：王国兴学号：xs139003放线菌在自然环境中分布广泛，存在于不同生态环境中，种类繁多，代谢途径多样，是一类用途广泛的生物资源。
在已经发现的抗生素中，有80%的抗生素来自于放线菌，因而放线菌愈来愈得到人们的重视和利用。
过去由于技术的制约，用形态特征、理化特性、菌体某些化学成分等方法分类及鉴定菌株，至今任然沿用，但是方法存在局限性。
近些年来，得益于分子生物学的快速发展，使放线菌的应用前景不可限量。
通过分子生物学实验技术，我们可以对放线菌进行细致的分类。
目前分类方面一般采用的做法是除了需要形态观察、培养特征、生理生化实验外，还要进行核酸序列或氨基酸序列的测定，其中相当有效的分类鉴别方法之一是采用PCR扩增16S rDNA进行序列分析。
对16S rDNA进行研究，一般的步骤是：（1）提高基因组DNA;（2）用λ噬菌体制备鸟枪DNA文库;（3）用16S rDNA特异性探针性筛选;（4）从含有16S rDNA的克隆中进行测定；（5）比较、分析序列。
本文将为大家介绍一类放线菌的筛选、分离与鉴定的方法。
1.材料采集样品，用高氏一号培养基（高氏一号培养基：可溶性淀粉2.0%、KNO3 0.1%、K2HPO4 0.05%、MgSO4 0.05%、FeSO4 0.001%、重铬酸钾0.01%，用海水1000mL配制，调节其pH7.2~7.4；医用抗生素药敏纸片、培养皿、载玻片、盖玻片等。
）或燕麦琼脂( ISP－3)（燕麦粉20.0g，微量盐溶液1.0ml，琼脂15g，蒸馏水1.0L，pH7.2）或放线菌发酵培养基（葡萄糖10g，糊精25g，燕麦粉20g，棉籽饼粉10g，鱼粉5g，糖蜜5g，干酵母2g，碳酸钙3g，蒸馏水1.0L）或LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1.0L，pH7.0）或PDA培养基（马铃薯浸提液500ml，葡萄糖10g，琼脂7.5g）进行培养。
放线菌检测标准版本
微生物总数检测方法(放线菌）一、检测用培养基配方与培养条件1.培养基：高氏1号培养基配方：可溶性淀粉 2g ，KNO30.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4• 7H2O 0.05g ，NaCl0.05g ，FeSO4• 7H2O 0.001g （母液），琼脂 2g ，自来水 100mL 。
先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。
在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。
调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。
2. 培养条件：温度：27℃-30℃；时间：36--48小时。
二、检测与计数方法1. 系列稀释称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用1mL无菌移液管分别吸取1.0mL上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。
3. 加样及培养取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。
当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
5. 菌落计数以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
放线菌筛选的一般方法 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】
放线菌筛选的一般方法
摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。
放线菌是革兰氏阳性细菌。
因菌落呈放线状而的得名。
常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
关键词：放线菌筛选微生物
1 放线菌的情况
放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。
因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。
大多数有发达的分枝菌丝。
菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。
可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。
是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。
放线菌因菌落呈放线状而的得名。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。
一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。
弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。
此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。
少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。
因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。
放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是
含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。
放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。
土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。
它是一个原核生物类群，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。
与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。
2 放线菌的培养基
高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。
这种培养基是采用化学成分完全了解的
纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO
3
、NaCl、
K
2HPO
4
?3H
2
O、MgSO
4
?7H2O?作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子
等组成。
高氏一号合成培养基需要K
2HPO
4
?3H
2
O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾
0.25,MgSO
4?7H2O 0.125g，FeSO
4
?7H
2
O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。
配制
时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，?121℃灭菌20分钟。
3 土壤中放线菌的分离
编号，分装取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。
每个稀释度做两个培养皿。
然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。
另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。
用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管
中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。
即为10-2浓度的土壤稀释液。
依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。
4 倒平板分离培养
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。
（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。
）
用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。
用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。
5 培养
接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。
6 菌种纯化
倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。
平板划线划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
7 进一步鉴定
用接种铲将平板上的菌苔连同培养基切下一小方块（宽2-3mm），菌面朝上放在载玻片上，另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气生菌丝、孢子丝和孢子）粘附（“印”）在载玻片的中央，将有印记的一面朝上，火焰固定，染色（1min），水洗，干燥，油镜观察。
8 确定放线菌
参考文献
[1]周长林微生物学北京市海淀区：中国医药科技出版社，2004：106008
[2]司美茹，薛泉宏等放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究微生物学通报 2004, 02期:61-65
[3]高鹏，薛泉宏等拮抗放线菌的筛选培养基与筛选方法研究西北农林科技大学学报(自然科学版) 2005, 01期:59-63
[4]冯轶男，杨润清放线菌分离与筛选方法的研究进展生物技术 2010, 第4期:95-97
[5]林雁冰，陆家贤等地黄根圈土壤拮抗放线菌筛选、鉴定及发酵条件优化植物保护学报2010, 03期:234-240。