放线菌筛选的一般方法(1)
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
几种利用预处理分离稀有放线菌的方法
目 前普 遍认为 ， 统方法 从土壤 中分离 培养 的微 生 用传 物 ， 数是经过 了一 轮 以上 活 性成 分 筛选 的链 霉菌 ， 大多 很 难 再分离 到新物种 。为 此必 须 不 断建 立一 些 新 的分 离 方 法 ， 发现放线 菌 的新物 种 和新 产 物 。近年 来 ， 以期 国内 外 学 者对稀有 放线菌 分离方法 的研究 已取得重 大进 展 ， 改 并 善 和建立 了一些有 效 的分 离 方法 。分 离得 到 了大量 的 稀
高氏二号平板（ 萘啶酸 ｌｎ／ Ｌ 制霉菌素 ５ ￣／ Ｌ 泛 Ｏ ｇｍ ， ０ ｇｍ ， 酸钙 １ｍ ／ ， ０ ｇＬ 维生素 Ｂ ０ ｇＬ 维生素 Ｂ ｍ ／ ， ３１ｍ ／ ， １１ ｇＬ 生物
素微量 ）２ ℃培养 ， — ２ 。 ，８ １ ４ ｄ ４ Ｅ Ｆ处理可 以减少单 细胞细菌 数量 。经 Ｅ Ｆ处理 与 Ｈ Ｈ 未处理相 比， 者较 大程 度 地增 加 了稀 有 放线 菌 的数 量 ， 前 且 分离得 到产活性 物 质 的稀有 放 线菌 比例也 较 未处 理 的 比例提 高了 １％ 一 ０ 。 ０ ２％
放线 菌能够产 生新 化 合物 的发 现标 志着 抗 生 素研 究 新纪元 的开始 ”。长期 的研究 重 点 集 中在 土壤 中 的优 势 菌链霉菌上 。然而 ， 随着 对这 一 类 群 菌的 广泛 筛 选 ， 量 大 生物活性 物质 的不 断发 现 ， 霉菌得 到新 的生物 活性 物 从链 质 的几率逐 渐下 降。稀 有 放线 菌逐 渐 引起 了新 药开 发 研 究 者们 的注 意 。 由这类 菌 产 生 的 抗 生 素也 不 断 被 发 现 。
摘
要： 稀有放 线茵是 生物活性物质的重要来源。本文主要从 物理 处理 、 学处理 、 化 生物学处理等 方面 ， 绍几种通 介
放线菌的选择分离培养
3,培养
平板倒置于 28℃培养箱中培养7天,观察菌落的生长情况,菌落特征.
�
1 ,取样
三 ,操作步骤
2, 制备土壤稀释液
3, 倾注平板
4,培养
四,实验操作内容
每组所需材料:
土样,装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶1瓶,9ml无菌水两支, 1或2ml移 液管2支,2副培养皿,60ml高氏1号培养基1瓶.
实验步骤
1,制备土壤稀释液 取土样0.5g,土样热处理后,加入装有无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中, 室温下手摇振荡10分钟,静止5分钟,用移液管取上清液1ml(10-2)加入到9ml 无菌水稀释到10-3,同样操作稀释到10-4.注意回收玻璃珠. 用移液管分别吸取10-2原液和10-4稀释液各0.5ml于标志稀释倍数的平板上 ( 10-2原液1个平行, 10-4稀释液1个平行).
二,平板分离法
A 平板划线分离法 B 倾注平板法 C 稀释涂布平板法
1)放线菌分离常用基础培养基 2)选择性培养基
选择培养基的设计
如:高氏一号琼脂;精氨酸-甘油琼脂;葡萄糖-天冬酰胺琼脂.
a,为抑制细菌及霉菌的生长,可加入链霉素(抑制细菌)和制霉素等. b,加入重铬酸钾可同时抑制细菌和霉菌的生长;对放线菌生长无抑制作用 .
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"生命科学导论"实验
放线菌的选择分离培养
一,放线菌的选择分离培养
1 ,目的要求
从土壤中分离纯化放线菌,初步掌握微生物的土壤中放线菌最丰富,品种齐全.从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣 中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和 嗜酸性的菌种. 土壤中含有丰富的放线菌,主要是链霉菌.而链霉菌以外的其他放线 菌,如小单孢菌,游动放线菌,诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要 的产生菌.但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法 很难得到. 对样品进行风干,干热处理,培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真 菌的数量;用干热和苯酚处理减少链霉菌数量的方法,可以分离得到更 多种类的放线菌.
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。
而得以快速分离纯化的目的。
如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。
在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。
如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。
实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。
原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。
B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。
首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。
与“放线菌”有关的知识例析
枝状菌丝体构成细胞体,一般分化为基内菌丝和气生
菌丝。其中，基内菌丝又叫营养菌丝，主要用来吸收营
养，气生菌丝主要与抱子生殖有关（参考答案:A） $
2放线菌的营养方式
除少数营寄生生活的致病菌外，放线菌多为腐生
异养型微生物。放线菌的培养形式主要有固体培养和
液体培养两种形式。它们能够吸收和利用的碳源主要
是葡萄糖、麦芽糖以及淀粉等，并且能够以蛋白胨、牛
肉膏、硝酸盐以及铵盐等作为氮源。此外，放线菌在生
长代谢的过程中还需要各种无机盐和一些微量元素。
例 3 细菌、放线菌、真菌的共同特征是 （ ）
A. 都没有成形的细胞核
B. 都是单细胞生物
C. 都用抱子繁殖
D. 都没有叶绿体，必须进行寄生或腐生生活
解析:细菌没有叶绿体，因此营养方式是异养，必
须依靠现成的有机物维持生活（只有少数硫化菌以分
D.分生抱子是最常见的放线菌抱子
解析:放线菌主要是通过抱子进行繁殖的，少数放
线菌还能借助菌体分裂片段进行繁殖（参考答案：8 $
例6下列有关生物的遗传现象和结论的叙述
中，不正确的是
（
）
A. R型细菌转化为S型细菌，是因为两种细菌在
一起培养时发生了 DNA 重组
B. 子房壁发育为果皮，其性状由母本基因决定,
用来培养真菌;高氏一号培养基是用来培养放线菌的
合成培养基;麦芽汁培养基是一种培养细菌和真菌的
常用天然培养基（参考答案:C） $
3放线菌的繁殖方式
自然条件下,大多数放线菌是通过气生菌丝分化
形成各种分生抱子进行繁殖的,仅少数是通过基内菌
丝分裂形成抱子状细胞进行繁殖的。放线菌形成抱子
主要有以下两种途径:一种是细胞膜内陷，再由外向内
放线菌的分离和鉴定
放线菌的分离和鉴定放线菌的分离和鉴定实验器材：1.⼟壤材料 5 ---10cm 处⼟壤，放于采集袋中带回实验室。
2.培养基淀粉琼脂培养基（⾼⽒Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% ⽢油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% ⼄醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成⾰兰⽒染液3( 1) 结晶紫染⾊液: 甲液结晶紫2g，95% ⼄醇20ml;⼄液草酸铵0. 8g，蒸馏⽔80ml。
甲⼄液先分别溶解，然后混合在⼀起，过滤除去残渣后装⼊滴瓶中备⽤。
( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏⽔100ml 先取少量蒸馏⽔加⼊碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加⼊全部蒸馏⽔，分装于滴瓶中备⽤。
( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%⼄醇100ml，溶解装⼊滴瓶备⽤。
4.仪器和其他⽤品⽆菌纸、带玻璃珠的三⾓烧瓶、1ml⽆菌吸管、⽆菌试管、⽆菌培养⽫⼀.⽬的要求：1. 掌握倒平板的⽅法和常⽤分离纯化微⽣物的基本操作。
2. 初步观察⼟壤中放线菌菌落形态。
3. 初步了解掌握微⽣物分类的基本⽅法。
⼆.实验原理：放线菌在⾃然界中主要⽣存于陆地和淡⽔中，⼟壤为这类微⽣物的主要习居场所，⽆论在种类和数量上都⽐其他地⽅繁多。
在中性或偏碱性的⼟壤和有机质等丰富的⼟壤中较多。
放线菌以孢⼦和菌丝⽚段的形式存在于⼟壤，每克⼟壤内含有数万、数⼗万的孢⼦。
放线菌的⽣活史和形态特征放线菌的孢⼦和孢囊孢⼦在适宜的环境下吸收⽔分，膨胀萌发，⽣出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。
因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体⼀般没有横隔，由于菌丝体长⼊培养基内和培养基表⾯，并纠缠在⼀起形成密集的菌落，所以⽤接种针将整个菌落培养基挑起⽽不破裂。
2株具抗菌活性的稀有放线菌的筛选和鉴定
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图２基于１６Ｓ ｒＲＮＡ基因Ｎ—Ｊ系统进化树，显示了菌株 ４５７２５，０６＿２２３０在类诺卡氏菌科中的系统进化关系
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第２６卷第５期 ２００９年１０月
生物学杂志
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（ＰＤＡ）上生长良好，基生茵丝丰富，无气生茵丝。２株菌的最适生长温度为２８屯，最适生长ｐＨ值７．０～７．５。综合２
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放线菌筛选的一般方法
摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。
放线菌是革兰氏阳性细菌。
因菌落呈放线状而的得名。
常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
关键词：放线菌筛选微生物
1 放线菌的情况
放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。
因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。
大多数有发达的分枝菌丝。
菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。
可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。
是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。
放线菌因菌落呈放线状而的得名。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。
一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。
弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。
此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。
少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。
因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。
放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。
放线菌只是形态上的分类，属于细菌界放线菌门。
土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。
它是一个原核生物类群，主要以孢子繁殖，其次是断裂生殖。
与一般细菌一样，多为腐生，少数寄生。
2 放线菌的培养基
高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。
这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、
K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。
高氏一号合成培养基需要K2HPO4•3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾
0.25,MgSO4•7H2O 0.125g，FeSO4•7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。
配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌20分钟。
3 土壤中放线菌的分离
编号，分装取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。
每个稀释度做两个培养皿。
然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。
另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min，即10-1的土壤悬液，静置30s。
用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。
即为10-2浓度的土壤稀释液。
依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。
4 倒平板分离培养
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约
10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。
（若融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，影响观察。
）
用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。
用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。
5 培养
接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。
6 菌种纯化
倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。
平板划线划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
7 进一步鉴定
用接种铲将平板上的菌苔连同培养基切下一小方块（宽2-3mm），菌面朝上放在载玻片上，另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气生菌丝、孢子丝和孢子）粘附（“印”）在载玻片的中央，将有印记的一面朝上，火焰固定，染色（1min），水洗，干燥，油镜观察。
8 确定放线菌
参考文献
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