植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定
桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌活性物质的分离及其初步鉴定
桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌活性物质的分离及其初步鉴定季敬霖;刘志民;马焕普【摘要】[ Objective] The paper was to isolate and preliminarily identify the antimicrobial active substances of antagonistic actinomycetes strain G19 obtained from the soil highly affected by peach crown gall (Agrobacterium tumefaciens). [ Method] The antimicrobial substances of antagonistic actinomycetes strain G19 were extracted using protein precipitation method, then isolated and purified using high performance liquid chromatography and middle-pressure chromatography. Its molecular weight was determined by MALDI-TOFMS method, and the related functional groups were verified through chemical color reaction. [ Result ] Seven peptide portions were produced from the antimicrobial substances of antagonistic actinomycetes strain G19 after isolation and purification with the molecular weights of 900 - 1 300 Da. It could be also inferred that it contained Cys, and carried with H2O and Na+. Color reaction of functional groups verified that the substance was polypeptide containing glycosyl. [ Conclusion] The result provided basis for the final definition of the structure of antimicrobial substances in antagonistic actinomycetes strain G19.%[目的]分离并初步鉴定从桃树高发根癌病土壤中获得的拮抗线菌G19菌株的抑菌活性物质.[方法]采用蛋白沉淀法对拮抗放线菌G19菌株的抑菌活性物质进行粗提,利用高效液相色谱仪、中压制备色谱仪对其进行分离、纯化,应用MALDI-TOFMS法进行分子量的测定,最后通过化学显色反应进行相关官能团的验证.[结果]经分离纯化后拮抗放线菌G19的抑菌物质被抨击出7个肽段,是分子量范围为900～1 300 Da,同时推断其含有一个Cys并携带H<,2>O,Na<'+>;官能团显色反应验证该物质为多肽且含有糖基.[结论]研究结果为拮抗放线菌G19菌株的抑菌物质结构的最终确定奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)015【总页数】4页(P9013-9016)【关键词】桃树根癌病;放线菌;抑菌肽【作者】季敬霖;刘志民;马焕普【作者单位】北京农学院植物科学技术学院,北京,102206;北京农学院植物科学技术学院,北京,102206;北京农学院植物科学技术学院,北京,102206【正文语种】中文【中图分类】S436.621.1桃树根癌病是由特殊功能的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以自然转基因引起的基因病害，是一种难以防治的土传细菌病害［1-2］。
放线菌筛选的一般方法
放线菌筛选的一般方法1.放线菌样本的收集：可以从自然环境中收集土壤、植物、水体等样本，也可以从实验室中保存的菌种库中选取菌种作为筛选对象。
2.放线菌的分离：将收集到的样本通过稀释涂布、均匀涂布等方法进行分离。
将分离出的放线菌菌落定植于选择性培养基上，利用差异营养需求、抗生素抑制等原理，筛选出纯培养基。
3.放线菌培养：将分离出的纯净菌株接种到适宜的培养基上进行培养，包括液体培养和固体培养。
液体培养可以用于代谢产物的筛选，固体培养主要用于菌株保存和鉴定。
4.代谢产物的筛选：通过对放线菌培养液或菌体提取物的分离、纯化和结构鉴定，筛选出具有生物活性的代谢产物。
常用的筛选方法包括生物测定法、波谱分析法等。
其中，生物测定法是通过对目标活性的生物测定，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗炎活性等，筛选出具有生物活性的化合物。
5.进一步筛选与优化：在获得具有初步生物活性的代谢产物后，可以进一步对其进行筛选与优化。
可以通过改变培养条件（如培养基、温度、pH值等）、发酵工艺等方式提高活性代谢产物的产量和纯度。
6.结构鉴定：对优选的生物活性代谢产物进行结构鉴定，通常使用核磁共振谱、质谱、红外光谱等波谱技术进行分析。
结构鉴定有助于揭示生物活性物质的药理作用机制，为后续研究提供基础。
7.生产量扩大与优化：当获得了具有潜在药用价值的放线菌菌株和代谢产物后，可以进行大规模的发酵生产以提高产量。
在此过程中，需要不断优化发酵工艺、培养基成分和培养条件，以提高产量和纯度。
综上所述，放线菌筛选的一般方法包括放线菌样本的收集、放线菌的分离、放线菌培养、代谢产物的筛选、进一步筛选与优化、结构鉴定和生产量扩大与优化。
这些方法的应用能够帮助科学家发现新的放线菌菌株和生物活性化合物，并为新药研发提供重要的基础信息。
放线菌的筛选
• 2.3菌株发酵滤液的拮抗性测定 选择初筛拮抗效果较好的放线菌进行液体发酵培养， 利用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定菌株 • 发酵滤液对不同病原菌的拮抗作用。 （1）发酵滤液的制备 将孢子浓度为108个/mL的放线菌接种到液体发酵培 养基中，于28℃，200 rpm/min摇床中恒温培养，5 d 后取发酵液于4500 rpm/min条件下离8min，上清液经 微孔滤膜过滤，得发酵滤液。 （2）抑制菌丝生长速率法测定滤液的拮抗作用 取1mL发酵滤液与9mL融化的PDA培养基充分混匀， 倒入无菌培养皿中制成带药平板。待培养基凝固后， 在板中央接入一直径为7 mm的病原菌菌饼（带有菌丝 的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加 1mL蒸馏水的PDA平板为对照。培养5d后，十字交叉 法测量供试病原菌菌落直径，通过下述公式计算抑制 率
• 1.4 主要仪器 BCD-265冰箱 FA2004N电子天平 pH S-3C酸度计 TGL-16G型高速台式离心机 YXQ-L31-400蒸汽灭菌锅 GRP-9050隔水式恒温培养箱 DL-CJ-2N高性能无菌实验台 HZQ-Q全温振荡器 QL-901旋涡混合器
• 2.方法 • 2.1土壤中放线菌的分离、纯化 • （1）土样的预处理 将采集到的土样自然风干，按1：10的比 例加入碳酸钙，28℃培养箱内放置5-7d。 • （2）土壤悬浮液的制备 研钵研磨预处理的土壤样品至颗粒均匀。 称取1g土样加入装有l0mL无菌水的试管中， 充分震荡10min，制成浓度为10-1的土壤稀 释液。吸取1mL上清液，加到装有9mL无菌 水的试管中震荡成10-2的稀释液。依照同种 方法制备浓度分别为10-3、10-4、10-5的土 壤稀释液。
• （3）管碟法测定滤液的拮抗作用 培养好的病原菌制成一定浓度的菌悬 液，与适量PDA培养基充分混匀，倒入 无菌培养皿内制成带菌平板。待培养基 凝固后，在板的中央放置1个牛津杯，加 入0.2mL发酵滤液，每个处理重复3次。 以加蒸馏水的PDA平板为对照。置28℃ 恒温箱中培养，5 d后利用十字交叉法测 量抑菌圈直径。 结合初筛及发酵滤液对病原菌的拮 抗试验，确定目的菌株。
植物病原真菌拮抗细菌的筛选鉴定及活性成分分析
Ｊ ｉ ａ ｎ ｊ ｕ ｎ （ Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ ０ ８ ３ ， Ｐ，Ｒ ．Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ；Ｓ ｈ ｉ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｌ ｕ ，Ｇ ａ ｐ Ｍｅ ｉ ｊ ｕ ａ ｎ （ Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ
褐 腐 病 菌 的抑 制 率 较 大 ， 分别为 ８ ７ ． ３ １ ％和 ８ ０ ． １ ５ ％（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ； 对棉 花 红 腐病 菌 、 辣椒炭疽病菌的抑制率低 于 ４ ０ ％ （ Ｐ＜ Ｏ ． ０ ５ ） 。Ｒ Ｎ 一 ６ １与枯 草芽孢杆 菌相似 度 最高， 为９ ９ ％， 确 定其为 芽孢杆 菌属 的枯草 芽孢杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｋ Ｒ Ｎ一 ６ １ ） ， Ｎ Ｃ Ｂ Ｉ 登 录号为 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｎ ｏ ．Ｋ Ｃ ８ ４ ０ ６ ６ ８ 。菌株 Ｒ Ｎ 一 ８ ８与 Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ， ｚ ∞ ｓ ｃ ｅ 瑚Ｆ １ １ ３等相似度 为９ ９ ％， 确定其为假 单胞菌属 的荧光假 单胞 杆菌（ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ｓ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｓ Ｒ Ｎ 一 ８ ８ ） 。对不 同盐浓度提取 的菌株 Ｒ Ｎ 一 ６ １ 抗 茵蛋 白 活性 研 究发 现 ， 效果最好的是饱和度为 ８ ０ ％的（ Ｎ Ｈ ） ， Ｓ ０ 溶 液 提 取 的 蛋 白。 蛋 白原 液 对 桃 褐 腐 病 菌 的抑 茵 活 性 最 强 ， ９ ６ ｈ后 的 病 原 真 菌 直 径 为 ２ ９ ． ０ｍｍ（ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） 。 关键 词 拮抗 细菌 ； 枯草 芽孢杆菌 ： 荧光假 单胞 菌杆 菌； 抑菌蛋 白 分 类号 ￥ ７ ６ ３ ． １ ３
植物病原真菌拮抗放线茵的筛选
ａ Ａ ｅｎ ｒ ｏ ｎ。 ｉ ｅ Ｕ ， ｋ ｒｉＣ ｒ ｌ ｉ ｆ ａ ， ｒａｉ ａ ｅｎｔ Ｆ ｌ ａ ｕ ａ Ｅ ｓｒ ｉ ｍ ｔｒ ｃ ｍ ｗ ｒ ｐｃ ｅ ｐａ ｉ ｉ ｔ ｓ ｒａ ａ ｌ ｉＧｂ ｒ ａ ｉ ｏ ｕｖ ａ ａ ｕ ｔ Ａ ｅｎ ｒ ｔ ａ ， ｕ ｉｆｌ ， ｘｅｏ ｌ ｃ ｕ ｅ ｉ ｄｕ ｄｃ ｏ ｈ ｉＳ ａ ｂ ｅ ｕ ， ｕ ｒ ｎ ａ ｈ ａ ｌｒ ａ ｖ ｖ ｈｕ ｕ ｉ ｅ ｋ ｓｎ ａ ｒ
密学的发展 ，放线菌又成为新微生物药物生
每年给粮食生产造成巨大的损失。目前对植物病害的防治 普遍采用化学农药 ， 而化学农药对非靶标生物的毒害 、 环境 的污染 、 害物抗药性的问题至今仍难 以解决 ， 因而生物防治
方法被认为是一条有效的途径 。放线菌是一类与人类关系
接种量接人发酵培养基（ 淀粉 ５．ｇ ｇ花生饼粉 ２ ．ｇ ｇ ０ ｋ ， ０／ ３ ｋ， ０，
（Ｈ４Ｓ ４ ． ｇｋ ， ａ Ｏ ４０ｇｋ ， Ｈ ７２ ，然后 置 于 ２ Ｎ ） Ｏ ０ ／ｇ Ｃ Ｃ ３ ． ／ｇ ｐ ．） ２ ４ ８℃ 、
转速 １０ ／ ｉ ５ ｍｎ的恒温摇床上培养 ５ 。 ｒ 测定时 ， １ ｌ 取 ５ 于 ｍ
６ ０ ｍ ｎ ０ ／ｉ 离心 １ ｉ， ０ ｒ ５ ｎ 取上 清液 进行 抑 菌活性 测 定ｒ ｍ ２ １ 。
ｉ ｉ ｔｓ． ４ ｓ ａｎ ｈ ｗ ｄｉ ｈｂ ｔ ｎ ｒ ｇ ｆ ｖ ｒ１ ｎｄ ａ ｔｒ Ｔ ｅｉ ｈｂ ｔ ｎ ａ ｔ ｉ ｆ ｅ ｍｅ ｔｔ ｎ ｂ ｏｈｗａ ａ ｕｅ ｙｔ ｅｃ ｐ ｎｔ ｓ ｅ ｔ １ ｔ ｉｓｓ ｏ ｅ ｎ ｉ ｉｏ ｉ ｓ ｅ ５ ｍｍ ｉ ｉｍｅｅ ． ｈ ｉｉ ｏ ｃｉ ｔ ｏ ｒ ｎ ａｉ ｒｔ ｓｍｅ ｓ ｒｄ ｂ ｈ ｕ — ｈ ｒ ｉ ｎ ｏｏ ｎ ｉ ｖｙ ｆ ｏ ｄ ｓ ｔｏ ． ｔ ｉｓ ｔ ｈ ｂｔ ｎｒ ｇ ｔ ｖ ｒ１ ｉｈｍｅｈ ｄ ４ ｓ ａｎ ｈ ｉ ｉ ｉ ｏ ｎ ｓ ｈ ｏ ｅ ５ｍｍ ｉｍｅｅ ｅｅｕ ｅ ｒｔｅｆｒｈ ｒ ｅ ｔ．ｔ ａ ｕ ｄｔ ａ ｂ ｔ ｔ ｉ Ｙ． ｎ ｓ ｒ ｗｉ ｎ ｉ ｉ ｗｉ ｉ ｄａ ｔｒ ｒ ｓ ｄｆ ｔ ｅ ｓｓ Ｉ ｗ ｓ ｏ ｎ ｔ ｏｈ ｓ ａｎ Ｓ ５ａ ｄｉ ｎ ｗ ｏ ｈ ｕ ｔ ｆ ｈ ｒ ｔ ｆｒ ｎａｉｎｂ ｏｈ ｈ ｄ ｓ ｏ ｇｉｈ ｂｔ ｎｅｆｃｓ ｎｔ ｅ ｅ ｎ ｕ ． ｅｍｅ ｔｔ ｒ ｔ ａ ｔ ｎ ｉ ｉ ｏ ｆ ｔ ｓ ｆ ｇ ｓ１ ｏ ｒ ｎ ｉ ｅ ｏ ｈ ６ｕ ０％ ｏ ｔｅｆｒ ｎａｉｎｂ ｏｈｈ ｄ ｉｈ ｂｔ ｎｅｆｃ ｒ ａ ｈ ｄ８ ． ｆ ｈ ｍｅ ｔｔ ｒ ｔ ａ ｉ ｉ ｏ ｆ ｔ ｅ ｃ ｅ １８％． ｅ ｏ ｎ ｉ ｅ
植物病原真菌拮抗细菌的筛选鉴定及活性成分分析
植物病原真菌拮抗细菌的筛选鉴定及活性成分分析任建军;师光禄;高美娟;王有年【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】为了获得应用于植物病害防治的高效广谱拮抗细菌菌株，从采自北京不同农田区的土样中分离得到103株细菌，采用平板对峙培养法、发酵产物活性测定法，并根据16 S rRNA基因序列分析以及生理生化反应鉴定、筛选了拮抗菌株。
选用不同饱和度的（ NH4）2 SO4溶液提取拮抗蛋白并分析其抗菌活性。
结果表明：分离的菌株中，菌株RN-61和RN-88对供试的10种病原真菌均具有明显的抑制作用；菌株RN-61和RN-88的发酵液对桃褐腐病菌的抑制率较大，分别为87．31％和80．15％（ P＜0．05）；对棉花红腐病菌、辣椒炭疽病菌的抑制率低于40％（P＜0．05）。
RN-61与枯草芽孢杆菌相似度最高，为99％，确定其为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis RN-61），NCBI登录号为GenBank accession no．KC840668。
菌株RN-88与Pseudomonas fluorescens F113等相似度为99％，确定其为假单胞菌属的荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens RN-88）。
对不同盐浓度提取的菌株RN-61抗菌蛋白活性研究发现，效果最好的是饱和度为80％的（ NH4）2 SO4溶液提取的蛋白。
蛋白原液对桃褐腐病菌的抑菌活性最强，96 h后的病原真菌直径为29．0 mm（P＜0．05）。
【总页数】7页(P126-132)【作者】任建军;师光禄;高美娟;王有年【作者单位】北京林业大学，北京，100083;北京农学院;北京农学院;农业部都市农业北方重点开放实验室北京农学院【正文语种】中文【中图分类】S763.13【相关文献】1.1株植物病原真菌拮抗细菌的鉴定 [J], 何亮;宋新华;王智文;吴凡;刘训理2.土壤拮抗细菌的分离与抗植物病原真菌活性初步研究 [J], 刘春来;李新民;王爽;夏吉星;杨帆;刘宇;苏宝华3.一种从土壤中筛选植物病原真菌拮抗细菌的新方法初步研究 [J], 吕娟;邓小叶;郑服丛;张荣意4.1株广谱拮抗植物病原真菌的芽孢杆菌HNA3的鉴定及其活性成分分析 [J], 徐菱菱;王丽;陈龙男;谢福莉;李友国5.大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析 [J], 王伟;李术娜;李红亚;王全;朱宝成因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拮抗农业致病真菌放线菌菌株C TF619-D的分离、筛选及初步鉴定
１ ． １ ． １ 供试放线菌
［ ３ ］ 徐
放线菌 由采 自黄河 的不 同水样 和土样
总糖含量较高 ， 这和会理县光 照和煦、 降水量较 多有关 ， 对 烟
茜， 周泽启 ， 巫常标．烟苗不 同移栽期对烤烟生长 、 产 量和质
中图分 类号 ： Ｓ １ ８ ２ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １ — ０ ０ ８ ６— ０ ４
放线菌 是一类具有广泛实际用途和 巨大经济价值 的微 生 物资源。它突出的特性之 一是能产生 大量 的、 种类繁多 的抗 生素 ， 是 生产 抗生素的主要菌群 ， 是研制新 医药 、 新农药 和生
瑛．移栽期对烤烟生长及产量 、 质量 的影响
草生长有 利 ， 使 烟叶含糖量 较高、 品质较好 。各移栽期 烟 叶中钾含量 基本 相当， 各部位 叶钾含量随移栽期 延迟 而降低 。
但移栽期对 钾含量无 明显影响 ， 烟叶钾含量均低于 ２ ％， 因此
量的影响［ Ｊ ］ ．福建热作科技 ， ２ ０ ０ ３ ， ２ ８ （ ３ ） ： ８ —１ ０ ．
较为协调。
［ ５ ］ 刘德育 ， 孙 广 玉， 蔡 淑燕．移栽 期 对烤 烟 叶片组 织结 构 的影 响 ［ Ｊ ］ ．中国农学 通报 ， ２ ０ ０ ５ ， ２ １ （ １ ２ ） ： １ ８ ７ — １ ８ ９ ． ［ ６ ］ 国家烟草专卖局科技教育 司．烟叶生产 与管 理［ Ｍ］ ． 北京： 北京
炭疽病菌 、 苹果腐烂病菌等 １ Ｏ多种真菌均有不同程度的抑制作用 ， 其 中对番茄炭疽病菌 的抑菌 圈最大能达到 ２ ． ８ ｃ ｍ。 通过对 Ｃ Ｔ Ｆ ６ １ ９一Ｄ菌株形 态特 征 、 培 养特 征 、 生 理生 化 特征 、 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序 列及 系 统发 育 分 析等 方 面 的研究 发 现 ，
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定一、培养基1 放线菌培养基高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。
放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。
2 放线菌形态及培养特征研究用培养基察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。
燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。
甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。
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Kauffmann等[10]方法，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中 平板法测定它们对2种植物病原细菌的拮抗作用，其中3株
检测其纯度。以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物 菌具有抑菌活性，结果(见图1)显示：W04、W01、W2R对水
27F(5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3')和1527R(5'- 稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌都有不同程度的抑
cinerea 、菜豆炭疽病菌Colletotrichum sp.、黄瓜立枯病 菌Fusarium solani 、烟草赤星病菌Alternaria alternata 、绿 色木霉Trichoderma viride 、番茄叶霉病菌Fulvia falva 、 水 稻 纹 枯 病 菌R h i z o c t o n i a s o l a n i 、水 稻 白 叶 枯 病 菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 、水稻细菌性条斑病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 、镰刀霉菌Fusaria 、无 名假丝酵母Candida famata ，以上均为浙江工业大学微生 物实验室保存菌种。
1.2.2 放线菌菌体对植物病菌的拮抗作用
(bootstrap)为1 000次重复。
采用平板对峙法 测Βιβλιοθήκη [5] 定放线菌对植物病原真菌的抑
3)培养特征及生理生化特性
菌 效 果 ：将 培 养 好 的 植 物 病 原 真 菌 用 打 孔 器 打 取 直 径
在部分培养特征培养平板上划线接种菌株W04，
为5 mm的菌块，然后将其倒置放在PDA平板中央，距中 28 ℃培养7~15 d后观察记录菌落特征[11]，并进行碳源、纤
放线菌是具有巨大使用价值的一类微生物，迄今已知 米小斑病菌Bipolaria maydis 、番茄灰霉病菌Botrytis
的抗生素中近2/3由放线菌产生[1-2]，其中在商业和医药中 使用的抗生素有75%由链霉菌产生[3]。在农用抗生素中已 获得农药登记的仅十余种，且主要用于防治水稻及大田农 作物的病害，而用于防治果蔬类重要真菌病害的则很少[4]。 在大力发展无公害果蔬生产的形势下，十分有必要开发防 治其真菌病害的农用抗生素。本文针对实验室筛选出的 放线菌，研究其对重要果蔬致病菌的拮抗活性，并鉴定其 分类地位，旨在发现新的抗生素或原有抗生素新的防治特
Isolation, Screening and Identification of Antagonistic Actinomycetes Inhibiting Plant Pathogens
WU Yan-hui, ZHAO Chun-tian, QIU Juan-ping
(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)
收稿日期：2009-10-27，修返日期：2009-12-08
基金项目：浙江省重大项目(农业生物技术专项)(2008C02007-2)
作者简介：吴艳辉(1985—)，女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事应用微生物学方面的研究。E-mail：wuyanhui1314@。
通讯作者：裘娟萍，教授，硕士生导师。Tel：0571-88320057，E-mail：qiujping@。
第2期
吴艳辉，等：植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定
147
用于无名假丝酵母培养。
扩增。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，
1.2 方法
1.2.1 土壤放线菌的分离与筛选 将土壤稀释液涂布到高氏1号平板上，30 ℃培养4 d，用
直径为5 mm的打孔器打孔，将琼脂块倒置于已涂布0.2 mL 终浓度为106个/mL无名假丝酵母的培养平板上，筛选对其 生长有抑制作用的菌株，测量抑菌圈大小并观察抑菌圈的 透明度和边缘整齐度。
AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')进行16S rDNA的PCR 制效果，W04的抑制作用最强烈。
1.2.4 菌株鉴定
2 结果与分析
2.1 土壤放线菌的分离与拮抗菌株的筛选 从采集到的11份土样中采用稀释平板法[5，13]共分离到
放线菌99株，用琼脂块法筛选到9株放线菌对无名假丝酵 母有显著抑制作用，采用十字交叉法测定其抑菌圈大小。 结果(见表1)表明：菌株W2R、W01、W04和W25G对靶标假 丝 酵 母 菌 的 抑 制 效 果 最 为 明 显 ，抑 菌 圈 大 而 清 晰 ，其 他 几株抑菌效果则相对较弱。
第49卷第2期 2010年2月
应用技术
农药
Vol. 49, No. 2 Feb. 2010
植物病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定
吴艳辉，赵春田，裘娟萍
(浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州 310014)
摘要：从杭州地区采集的11份土样中共分离到99株放线菌，筛选出9株对产核黄素的无名假丝酵母Candida famata 有拮抗作用。采用平板对峙法复筛到1株对供试的多种植物病原菌抑制效果较强的菌株W04，该菌株对西瓜枯萎 病原菌的抑菌率达到79.1%；生长速率法测得其发酵滤液对西瓜枯萎病原菌的抑制率为82.6%。根据形态特征、生 理生化特性及16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为淡紫灰链霉菌Streptomyces lavendulae Waksman & Curtis。 关键词：放线菌；植物病原菌；抑菌活性；分类鉴定 中图分类号：S482.2 文献标志码：A 文章编号：1006-0413(2010)02-0146-04
性，为丰富防治果蔬类病菌生物农药种类提供实践经验和 1.1.3 供试培养基
理论依据，为农用抗生素的研究与应用奠定基础。
PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基用于抑菌试验；高
1 材料与方法 1.1 材料
氏1号培养基用于放线菌分离培养；种子培养基(葡萄糖 1.0%，酵母粉1.0%，蛋白胨0.2%，鱼粉0.5%，pH值7.2)与 发酵培养基(可溶性淀粉4.0%，葡萄糖1.5%，鱼粉0.5%，酵
55 ℃ 复 性 4 5 s ，7 2 ℃ 延 伸 7 5 s ，3 0 个 循 环 ；7 2 ℃ 延 伸 1 0 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，Gel Extraction Kit切胶回收。pGM-T克隆试剂盒进行PCR扩增产物的 连接，连接产物转化 E. coli DH5α ，将阳性克隆的菌液交 上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列与 GenBank数据库中序列进行BLAST分析。用DNAMAN 软件对所得序列与相似性较高的菌株进行同源性分析， 用MEGA 4软件采用邻接法构建系统发育树，自展系数
表1 不同放线菌的抑菌圈大小及形态
供试放线菌菌株 W04 W2R W01 W25G W09 W13 W14 W29 W33 对照
抑菌圈/mm 25.3 18.5 20.7 15.4 9.2 11.6 7.4 8.2 8.8 0.0
抑菌圈形态 透明、边缘清晰 透明、边缘清晰 透明、边缘较清晰 透明、边缘清晰 透明、边缘稍模糊 透明、边缘稍模糊 半透明、边缘模糊 透明、边缘稍模糊 透明、边缘稍模糊
糖60 g/L，甘氨酸2.3 g/L，生物素11.8 μg/L，(NH4)2SO4 8.1 g/L， KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.72 mg/L，CoCl2 11.8 mg/L， CuSO4·5H2O 20 μg/L，Na2MoO4 0.14 mg/L，H3BO3 20 μg/L， MnSO4 20 μg/L，ZnSO4·7H2O 17 mg/L，FeSO4·7H2O 2 mg/L)
央25 mm处呈“+”字倒放同样大小的供试放线菌菌块。以 维素利用和淀粉水解等生理生化特征分析[12]。
只接病原菌的平板为对照，试验重复3次。28 ℃培养至对
照平板上病原真菌长满平皿，测量病原菌菌落直径，通过
公式(1)计算菌丝生长抑菌率。
生长抑制率(%)= 对照菌对落照直菌径落-直处径理菌落直径×100
孢子丝及孢子形态。
表明：W04、W2R和W01抑菌谱较广，对以上10种供试病原
2)16S rDNA序列分析以及系统发育树的构建
真菌均有不同的抑制效果，尤其对西瓜枯萎病的抑制率最
菌 株 基 因 组 D N A 的 提 取 参 照 N i k o d i n o v i c [9]、 高。其他几株放线菌抑菌效果较弱，且抑菌谱窄小；双层
无
注：其他菌株均无抑菌效果，故未在表1中列出。
1)形态特征观察
2.2 放线菌菌体对供试植物病原菌的拮抗作用
高氏1号琼脂平板中采用插片法[8]将菌株W04在28 ℃
以10株植物病原真菌为指示菌，采用平板对峙法测定
培养箱中培养5~10 d，显微镜下观察气生菌丝、基内菌丝、 筛选到的9株放线菌的拮抗活性，测得抑菌率见表2，结果
10%的接种量接入发酵培养液，置于(28±1) ℃、转速为 200 r/min的恒温摇床上培养5 d[7]后，通过细菌过滤器得到 无菌滤液，吸取3 mL注入无菌培养皿中，将15 mL冷却至 50 ℃左右的PDA培养基倒入培养皿中，混合均匀，凝固后 接入西瓜枯萎病菌菌块(直径5 mm)，以加3 mL无菌水的 PDA平板为对照，重复3次。3 d后测量菌落直径，根据公 式(1)计算抑菌率。
(1)
双层平板法[6]测定放线菌对病原细菌的抑制作用：先
在培养皿中倒入10 mL琼脂培养基，凝固后再倒入10 mL
含有病原细菌菌悬液的牛肉膏蛋白胨培养基，待凝固后在
距平板中央15 mm处呈“+”字倒置放入放线菌菌块，28 ℃
培养24 h，观察抑菌效果并测量抑菌圈直径。
1.2.3 放线菌发酵滤液对植物病原菌的抑菌活性测定 将不同菌株接入种子培养液培养48 h，按体积分数