病原菌的分离培养和纯化
实验二植物病原菌的组织分离
实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。
二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。
期间融化培养基备用。
（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。
在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。
（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。
（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。
倒置于25—28℃恒温箱内培养。
（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
实验六 土壤中真菌纯化、分离和培养
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种 方法。
混菌法和涂抹法。
混 菌 法
涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板 倒置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数
6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培 养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时 进行深入研究。
?4挑菌纯化?5计数?6菌种保存将分离到的真菌转接到pda斜面上培养待长好后置于冰籍中保存必要时进行深入研究
实验六
土壤中真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法， 从而获得真菌纯培养技能；了解基本接 种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发 现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。 不同土样中各类微生物数量不同，一般土 壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。 本次实验从土壤中分离真菌。
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精 灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法 进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90 mL无菌水）和4管9mL的无菌水排列好， 按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸 取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水 中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓 度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯 度的菌液需换用不同的吸管。
食品中的食源性病原菌检测
食品中的食源性病原菌检测食品安全一直是人们关注的重要问题。
随着食品供应链的延长和国际贸易的增加，食品中的食源性病原菌检测变得尤为重要。
食源性病原菌是指通过食品传播给人类的一类微生物，它们可能引发食物中毒、胃肠道感染等疾病，对人体健康构成潜在威胁。
要保证食品的安全，必须在食品生产和供应环节中进行食源性病原菌的检测。
食品中的病原菌检测主要包括样品采集、分离培养、基因检测等步骤。
首先，样品采集是食品中病原菌检测的第一步。
在收集样品时，要遵循严格的卫生标准，避免交叉污染。
不同食品有不同的采样方法，例如水果和蔬菜可以通过切割表面、冲洗等方式进行采样，而肉类和乳制品需要进行真空袋封装等方法。
采集的样品应该在适当的环境条件下保存，以确保后续的检测能够准确可靠地进行。
其次，分离培养是食源性病原菌检测中的重要环节。
它通过将样品中的病原菌分离出来，并进行纯化培养，以便后续的检测和鉴定。
传统的分离培养方法包括在适当的培养基上进行培养，通过观察菌落形态、生理生化特性等来鉴定病原菌的种类。
然而，传统方法需要较长的时间，通常需要几天到几周才能获得结果，这在一些紧急情况下显得不够迅速。
随着生物技术的发展，基因检测在食源性病原菌检测中得到了广泛应用。
基因检测利用PCR或实时荧光定量PCR等方法，通过检测病原菌的核酸序列来确定其存在。
这种方法不仅速度快、准确性高，还可以同时检测多种病原菌，提高了检测效率。
此外，基因检测还可以应用于食品中的病原菌溯源，帮助追踪和控制食品安全事故。
除了样品采集、分离培养和基因检测，食源性病原菌检测还需要建立完善的质量控制体系。
质量控制包括方法验证、实验室设备校准、人员培训等环节，以确保检测结果的准确性和可靠性。
食品生产企业和监管机构应密切合作，建立检测数据的共享和交流机制，加强对食品中食源性病原菌的监测和防控，保障消费者的食品安全。
总之，食品中的食源性病原菌检测对于保障食品安全至关重要。
通过严格的样品采集、分离培养和基因检测等步骤，我们可以及时准确地检测出食品中的病原菌，保障消费者的身体健康。
病菌纯化培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握病菌纯化培养的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作技术，确保实验结果的准确性。
3. 通过实验，加深对病菌生长、繁殖特性的理解。
二、实验原理病菌纯化培养是微生物学实验中的重要环节，其目的是从混杂的微生物群体中分离出单一菌株。
通过选择合适的培养基和适当的培养条件，可以使目标病菌生长繁殖，同时抑制其他微生物的生长，从而获得纯培养。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 土壤样品- 病菌培养皿（平板）- 病菌接种环- 病菌培养箱- 显微镜- 病菌分离培养基- 生理盐水- 75%酒精- 灭菌棉签- 紫外线消毒灯2. 实验仪器：- 灭菌锅- 灭菌器- 高压蒸汽灭菌器- 电子天平- 移液器- 恒温水浴锅四、实验步骤1. 样品采集与处理：- 从土壤中采集适量样品，放入无菌容器中。
- 将样品用生理盐水稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3等不同浓度的稀释液。
2. 平板划线法分离：- 将稀释液分别涂布在平板分离培养基上。
- 使用无菌接种环，按照平板划线法进行划线操作。
- 将划线后的平板倒置，放入培养箱中，在适宜的温度和湿度下培养。
3. 单菌落挑取：- 观察平板上的菌落，选择单个、形态一致、生长良好的菌落。
- 使用无菌接种环，将单个菌落挑取至新的平板分离培养基上。
- 重复上述操作，直至获得纯培养。
4. 纯培养鉴定：- 将纯培养的病菌进行显微观察，记录其形态、大小、颜色等特征。
- 对纯培养的病菌进行生化实验，鉴定其种类。
5. 结果记录与分析：- 将实验结果进行记录和分析，包括菌落特征、显微观察结果、生化实验结果等。
五、实验结果与分析1. 菌落特征：- 观察到纯培养的病菌菌落呈圆形、光滑、湿润、边缘整齐，菌落大小约为1-2mm。
2. 显微观察结果：- 显微镜下观察到纯培养的病菌为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，长度约为1-2μm。
3. 生化实验结果：- 纯培养的病菌在葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类培养基上生长良好，产酸产气。
常见病原菌分离方法
常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。
，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。
材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。
如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。
分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。
二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。
振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。
直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。
三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
病原物的分离培养和纯化
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
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普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。
最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。
(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。
(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。
(5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。
(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。
(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。
2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。
3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。
0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml。
先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。
升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。
四、实验操作(一)病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：(1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。
提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
(2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c 左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。
凝固后即成平板培养基。
提示：加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。
除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。
加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg ／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。
除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加入。
倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。
(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3--4mm)病组织数块。
提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。
腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
(4)将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。
然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。
升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3，5min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4--6块。
提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养。
一般3—4d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。
在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可置于冰箱中保存。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。
如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的蕾落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上，完成分离工作。
2．稀释分离法(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。
(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化开冷却到45～50c的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。
为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50c。
(5)将培养皿翻转后置恒温箱(2513)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌。
将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25℃左右培养。
待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。
(二)病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。
在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。
稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30c恒温箱中2—4h，使表面无水滴凝结。
也可凝成平板后直接使用。
(2)将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20—60min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。
划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。
灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28c 恒温箱中培养。
1—3d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。
同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。
最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
(三)真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种，按前述稀释分离法中(1)--(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。
记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。
同时要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
2．细菌培养性状观察(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。
同时要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。
也要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。
也要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。
五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织，表面消毒，无菌水洗移人平板：1h。
稀释分离：配孢子悬液，倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线，1h。
稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种。
2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告。