几种酶的测定方法

4.3 测定指标及方法
4.3.1 芽长、根长、发芽率及生根率
选取发芽的种子测量芽长和根长，取平均值。

发芽率:发芽率（%）=n/N*100(n 为发芽种子数，N 为供试种子总数）。

4.3.2 淀粉酶测定
采用3，5-二硝基水杨酸法测定540nm 处麦芽糖的吸光度变化来得出淀粉酶活力[119]。

1）、称取1g 小麦在研钵里研磨（加入数克石英砂），再加入4 ml 1%氯化钠溶液，再用1%氯化钠溶液洗净该研磨物洗入10ml 离心管里，在3000转/分钟 的转速中离心10 分钟。

再将上清液倒入100ml 容量瓶，再用磷酸缓冲溶液定容，即可制备各培养皿的酶溶液。

2）、取酶溶液0.5ml 放入试管中,置于40摄氏度恒温保温15分钟，再加入40摄氏度预热的1%淀粉溶液2ml,保温5分钟，取出后向各试管加入4ml 0.4 mol/L 氢氧化钠溶液，振荡均匀后再加2ml DNS 试剂。

3）、将各试管置沸水煮沸5分钟，加蒸馏水定容至20ml 。

4）、最后，用可见分光光度计在540nm 下测定各试管的吸光值，从而计算出各试管的酶活量。

4.3.3 丙二醛含量的测定
于532nm 和600nm 波长下测定光密度，计算丙二醛含量[120]。

（1）酶液提取
称取萝卜叶片lg 放入研钵，加少许pH7.0的磷酸缓冲液和石英砂，研磨成匀浆，移人50ml 容量定容。

再从其中取出一部分离心，上清液即为酶液备用。

吸取3ml 酶提取液放入刻度试管中，加入5ml 0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液，在沸水浴上加热10分钟，迅速冷却，以4000转/分离心10分钟。

取上清液在532nm 和600nm 波长下，测定光密度（以不加酶液的对照调零）
（2）结果计算
W .a V A ）-D （D -⨯⨯⨯⨯=
⋅16605321-10551g nmd ）丙二醛含量（
A —反应液总量（4ml ）；
V —提取液总量(5m L)；
a —测定用提取液量(1.5m L)；
W —植物样品重量(g)；1.55×10-1 —丙二醛μmol ·l-1的消光系数。

）
4.3.4 脯氨酸的测定
在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应产生稳定的红色产物，该物质的最大吸收峰是520nm ，脯氨酸含量用酸性茚三酮法测定[121]。

（1）绘制脯氨酸标准曲线，配制脯氨酸溶度为l00μg/ml 的母液。

取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、12.5、10.0ml 分别放入7个50m1容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至50ml ，配成0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0ug/ml 的溶液。

分别取上述各溶液2ml ，加入已编号的7个试管中，再分别加入2ml 酸性茚三酮试剂、1ml 冰醋酸、1ml 3％磺基水杨酸溶液；摇匀之后，在沸水浴中显色30分钟，取出后冷却至室温，向各管加入2ml 甲苯，充分振荡，以萃取红色产物。

萃取后静置，使红色物质转入甲苯层；用滴管轻轻吸取红色的溶液于比色杯中，在分光光度计520nm 波长处测定吸光率；以脯氨酸含量和吸光率绘制标准曲线。

（2）游离脯氨酸的提取：称取0.1～0.5g 小麦，剪碎后放人具塞试管中，加5m1 3％磺基水杨酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10分钟，过滤液待测，也可直接吸取提取清液测定。

（3）游离脯氨酸曲测定取提取液2mI 于具塞试管中,加入1ml 水、1ml 冰醋酸和2ml 酸性茚三酮试剂，摇匀后在沸水浴中加热显色30分钟，取出后冷却至室温，加入2ml 甲苯，充分振荡，以萃取红色产物。

再静置使其分层，待完全分层后，吸取甲苯层，于分光光度计520nm 波长处测定吸光率。

（4）计算样品中脯氨酸的含量
W a V
C ）/g ⨯
=脯氨酸含量（μ
10010W a V C =)%(6⨯⨯⨯脯氨酸含量
C —由标准曲线查得脯氨酸μg 数； V —提取液总体积（ml ）；
a —测定液体积（ml ）；
W —样品重（g ）
4.3.5 过氧化物酶活性的测定
采用愈创木酚法测定过氧化氢酶（POD ）活性[122]。

（1）酶液提取：取小麦2g ，剪碎置于研钵中，加5mL 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.5），研磨成匀浆，以 4 000rpm 离心5min ，倾出上清液，必要时残渣再用5mL 缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱（或冷处）备用。

（2）取光径1cm 比色杯2 个，向其中之一加入上述酶液150ul （如酶活性过高可稀释之），再加入2ml0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）0.5ml0.75%H 2O 2,0.5ml0.25%愈创木酚，立即开启秒表记录时间；而向另一
比色杯中加入0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0），作为零对照。

用分光光度计在470nm 波长下测定反应5min 时的光密度值。

（3）结果计算
以每分钟光密度变化（以每分钟OD470nm 变化0.01 为1 个活力单位）表示酶活性大小，即：
过氧化物酶活力 =·Vt/(0.01·W ·Vs ·t)
：反应时间内吸光度之变化
Vt ：提取液总体积
W ：叶片质量
t ：反应时间
Vs ：测定时用酶液体积
4.3.6 过氧化氢酶活性的测定
在pH7.7条件下，从样品中提取过氧化氢酶，在提取液中加入一定量的过氧化氢，使过氧化氢在过氧化氢酶作用下分解，再用1.0mol/L 高锰酸钾溶液滴定过量的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的消耗量计算出试样中过氧化氢酶活动度[123]。

（1）高锰酸钾标准溶液配制和标定：
称取6.6g 高锰酸钾，溶于1050mL 水中，缓慢煮沸15min ，冷却，于暗处放置两周，用已处理过的4号玻璃滤埚过滤，贮存于棕色瓶中。

称取0.25g 草酸钠，溶于100mL 硫酸溶液中，用配置好的高锰酸钾溶液滴定，反应液温度应保持在60℃左右，继续滴定至溶液呈粉红色，并保持30s 。

同时做空白试验。

A470nm ∆A470nm ∆
高锰酸钾标准滴定溶液的浓度[c(1/5KMnO 4)]，数值以摩尔每升（mol/L ）
表示按公式（3.2.1）计算：
)(1000)51(214V V M m KMnO c -⨯= ……………. (3.2.1)
式中：
m —草酸钠的质量，单位为克（g ）；
V1—高锰酸钾溶液的体积，单位为毫升（mL ）;
V2—空白试验高锰酸钾溶液的体积，单位为毫升（mL ）;
M —草酸钠的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol ）。

（2）测定方法
①酶液提取：称取小麦lg 放入研钵，加少许pH7.0的磷酸缓冲液和石英砂，研磨成匀浆后，移人50ml 容量定容。

再从其中取出一部分离心，上清液即为酶液备用。

②测定酶活性取4个三角瓶编号，1、2号瓶备加1ml 煮沸酶液为对照，3、4号瓶分别加入酶液1ml ，再向各瓶分别加入1％H 2O 22.5m1。

置于30℃
水浴上保温10分钟，立即向各瓶加入1％H 2SO 42.5ml 终止酶反应。

用标定
过的0.1mol/L KMnO 4滴定剩余的H 2O 2至粉红色在半分钟内不消失为止。

求
出1、2号和3、4号瓶的平均滴定值。

③酶活性计算
被分解的H 2O 2量（mg ）=[对照滴定值(ml)-样品滴定至(ml)]×KMnO 4的浓度×1.7mg
（3）结果计算：
过氧化氢酶活动度X 按下式计算：
100205017)100()(10⨯⨯⨯-⨯⨯-=M m c V V X ………… (3.2.2)
式中：
X —过氧化氢酶活动度（以干基计）单位为毫克过氧化
每克（mg H 2O 2/g ）;
V0—空白实验用去高锰酸钾体积，单位为毫升（mL ）;
V1—试样滴定用去高锰酸钾体积，单位为毫升（mL ）;
C —实际高锰酸钾标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L ）;
m —试样质量，单位为克(g);
M —试样水分含量，%：
17—与1.00mL 高锰酸钾标准溶液[c(1/5KMnO 4)=0.2mol/L]相
当的H 2O 2的质量；。