中和试验
微量细胞病变中和试验名词解释
微量细胞病变中和试验名词解释
微量细胞病变(微小的细胞病变)是指在组织、器官或细胞水平上出现的单个或少量细胞的异常变化。
这些异常细胞变化通常是由外界因素(如化学物质、病毒、细菌等)或内部因素(如代谢紊乱、遗传因素等)引起的。
微量细胞病变可以导致组织受损、器官功能异常和疾病发生。
中和试验是一种检测微量细胞病变的常用方法。
中和试验是通过向样本中引入特定的化学物质,观察这些物质对细胞的影响来确定细胞病变的存在。
这种试验通常需要使用一定浓度的化学物质,并且需要严格控制实验条件,以确保实验
结果的准确性和可靠性。
微量细胞病变和中和试验之间的联系在于,它们都与细胞和分子水平上的异常变化有关。
微量细胞病变可以通过多种方式引起,包括病毒感染、化学物质中毒、遗传因素等。
而中和试验则是通过对样本中化学物质的影响来检测微量细胞病变的存在。
因此,中和试验可以用于诊断和监测微量细胞病变,并为疾病诊断和治疗提供支持。
除了用于检测微量细胞病变,中和试验还可以应用于其他领域。
例如,在生物医学研究、药物开发、环境保护等方面,中和试验都具有重要的应用价值。
此外,中和试验还可以用于检测某些遗传性疾病、代谢性疾病等,为这些疾病的诊断和治疗提供依据。
微量细胞病变和中和试验是两种不同的细胞和分子检测方法,但它们之间的联系和应用领域非常广泛。
随着技术的发展和应用场景的不断扩大,微量细胞病变和中和试验将在生物医学研究、疾病诊断和治疗等领域发挥越来越重要的作用。
中和试验
第十三章 中和试验（neutralization test）学习要点：毒价滴定； 终点法中和试验； 空斑减少试验。
病毒或毒素与相应的抗体结合，抗体中和了病毒或毒素，失去了对易感动物的致病力，这种试验称为中和试验。
一、简单定性中和试验——毒价滴定主要用于鉴定病料中病毒及病毒的类型，亦可用于毒素的鉴定。
试验方法：根据病毒的易感性选定试验动物（鸡胚或细胞）及接种途径。
将动物分为对照组与实验组。
试验组：取待检病料磨碎，加生理盐水稀释，加双抗，在冰箱中作用1h或经过滤器过滤，与已知的抗血清等量混合，置于37℃中作用1h后接种动物。
对照组则用正常血清加入稀释病料，作用后，接种另一种动物。
对照组动物发病死亡，而试验组动物不死，即证实病料中含有与已知抗血清相应的病毒。
二、终点法中和试验1、固定血清稀释病毒法将病毒用2倍递增稀释，分置二列试管：第一列加入正常血清（对照组）；第二列加入待检血清（试验组）。
二列试管分别振荡均匀，置370C中作用1h，将各管混合液分别接种试管动物，每管用3-5只动物。
接种后观察数目，并记录死亡数。
观察结束后，计算起LD50及中和指数。
2、固定病毒稀释血清法本法用以测定抗病毒的血清中和效价。
将待检血清稀释，加等量已知毒价的病毒液，在试管内中和湖接种动物，观察动物发病及死亡情况，计算其只能中和效价。
三、空斑减少试验在细胞培养时作中和试验可采用空斑减少法。
一种能使细胞致病变的病毒，在细胞培养上生长后，因其致病变作用使细胞单层脱落，pH与无病变地方也不一样，该处与周围明显不同的、一个局限性的变性细胞区称为空斑。
一个空斑可以当作一个病毒生长的集落，一个单位内空斑数多，病毒就多，故可测出病毒空斑形成单位。
这样，加抗血清与不加抗血清的病毒空斑形成单位之差，就称为空斑减少试验。
使空斑减少50%的血清西式度，就是该血清的中和价。
复习思考题：1、滴定毒价的常用单位？2、什么是中和价和中和指数？。
[医学]免疫学课件——第十一章 中和试验
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先将病毒稀释成每一接种计量含100空斑 单位(PFU),加等量稀释的血清,37℃1小时.每一 稀释度接种3个已形成单层细胞的空斑瓶,同时 用同样稀释的病毒加等量的Hanks液作为对照.
免疫学原理与技术
空斑减少法中和试验
病毒稀释液
100PFU/0.5毫升
免疫学课件——第十一章 中 和试验
病毒或毒素与相应的中和抗体结合后,可使 其失去致病能力,此种中和反应有严格的种,型 特异性,而且还可以定量,所以可以定性,定量检 测病毒,毒素或抗体.
中和试验是以病毒或毒素对生物系统的毒 力为基础的,所以首先根据病毒,毒素特性选择 合适的细胞,鸡胚或试验动物,测病毒,毒素对其 毒价,再测抗体中和后的毒价,如果毒价有较明 显的变化,说明抗原,抗体发生了反应,即抗体对 病毒或毒素发生了中和.而且还可以根据毒价 的变化,来判断血清中抗体中和病毒或毒素的 能力—中和价(抗体的定量)
%
数
数
10-4
6
0
100
13
0
13/13
100
10-5
5
1
83
7
1
7/8
88
10-6
2
4
33
2
5
2/7
29
10-7
0
6
0
0
11
0/11
0
注:CPE为细0-5-lgTCID50 88%-50%
=
lg10-5-lg10-6
88%-29%
lgTCID50=-5.64 TCID50=10-5.64,0.1毫升
血清中和价(lg)=L+d(S-0.5)
中和试验
中和试验中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。
所属分类：免疫学概述动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。
Y3r3X。
中和试验(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。
GMlpm。
两种试验方法介绍中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。
XNI6d。
(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。
但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。
用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。
在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
shW6H。
(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。
测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10、10、10……10，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。
中和试验
测定方法:将接种病毒，并已发病濒死的小鼠,无菌法取脑组织,称重、加稀释液充分研磨，配制成１0-1悬液，3 000r/ｍin离心20分钟,取上清液，以1０倍递次稀释成1０、10、10……10,每个稀释度分别接种５只小鼠，每只脑内注射0.0３ml，逐日观察记录各组的死亡数。
IgLD50(或ＴＣIＤ50）＝L+d(S－０．5)
Ｌ为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数,S为死亡比值的和。本例Ｌ=－４,d＝-1,S＝1+1+5/６+1/6=3
IgLD50＝-４＋(-1）×(3-0．5)
=-6.5
则LＤ50＝10,0.０3ml
注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。
(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围,将病毒液作10倍递次稀释,使之成为所需要的稀释度。
(4)感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内,第一排每管加入与病毒等量的免疫(或被检)血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组;充分摇匀后放37℃感作12ｈ。
(５)接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物(或鸡胚、组织细胞)。观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。
(２）EID50的测定(以新城疫病毒为例)将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成1０-1、1０-2、10-3……1０-９不同稀释度，分别接种9-1０日龄鸡胚尿囊腔,鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.２ｍl,每个稀释度接种6只鸡胚为一组,以石蜡封口,置37-38℃培养，每天照蛋,24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置４℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性,记录结果,按上述方法计算EＩD50。
中和试验
4.病毒的中和抗体（neutralization antibody ）指：针对病毒某些表面抗原的抗体，此类 抗体能与细胞外游离的病毒结合从而消除病 毒的感染能力。 5.中和抗体的作用机制：
①直接封闭病毒表面抗原，如与病 毒表面吸附蛋白（VAP）结合，从 而阻断病毒的吸附
②改变病毒表面结构
6.病毒中和试验：Neutralization of a virus is defined as the loss of infectivity through reaction of the virus with specific antibody.
• 以测定病毒感染力为基础，以病毒受免疫 血清中和后残存的感染力为依据，来判定 免疫血清中和病毒的能力。
步 骤 三
加至已长成单层 的MRC-5细胞
16h，18h，20h 所铺细胞数目要求较高，防止细胞叠层
梯度乙醇固定细胞， 封闭30min
相继用IE1单抗， 生物素标记羊抗鼠IgG，
链霉亲和素-HRP， 以及底物显色
图像采集与数据处理
步骤一 步骤二 步骤三
实验组
病毒对照
细胞对照
25μ l血清 25μ l维持液 25μ l维持液
以hcmv中和抗体效价测定为例2倍稀释血清样02ml2倍稀释血清样品终体积02ml200pfu02ml200pfuhcmv每孔02ml加到成单层mrc5细胞37孵育1h弃去液体弃去液体pbs洗三含03琼脂的维持液覆盖35天再次覆盖14天甲醛固定孵育1h甲基蓝染色中和抗体效价的测定同时设病毒对照和细胞对照病毒对照组只加病毒不加血清细胞对照组用维持液代替血清和病毒
体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接 种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻 击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫 苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。
红细胞中和试验操作规程
红细胞中和试验操作规程
《红细胞中和试验操作规程》
一、实验目的
红细胞中和试验是一种用于检测体液中抗体和抗原反应的实验方法。
本实验的目的是通过红细胞中和试验来判断患者的血清中是否存在特定的抗体，并对其抗原进行鉴定。
二、实验仪器与试剂
1. 离心机
2. 玻璃试管和试管架
3. 1% 的红细胞悬液
4. 不同血型抗体
三、实验步骤
1. 取一根试管，在底部标记所需进行的血型和试验样本编号。
2. 取充分标记的血样和同等数量的1%红细胞悬液，混合均匀。
3. 在37℃孵育20分钟。
4. 用离心机离心5分钟。
5. 观察红细胞悬液下清液的混浊度，判断是否发生了红细胞中和反应。
四、实验结果判定
1. 若上清液清澈，表示未发生红细胞中和反应。
2. 若上清液混浊，表示发生了红细胞中和反应，即患者血清中含有特定抗体。
五、实验注意事项
1. 实验过程中要严格遵守无菌操作，以免污染。
2. 实验操作时要注意用手套和口罩，避免细菌感染和呼吸道排放。
3. 实验结束后，要将试管和实验仪器及时清洗消毒，以保持实验室卫生。
六、实验结果记录
实验结束后，要将实验结果准确记录在实验记录表中，并及时归档保存。
以上就是关于红细胞中和试验操作规程的详细介绍，希望能对您有所帮助。
酸碱中和实验
酸碱中和实验酸碱中和实验是化学实验中常见的一种实验方法，用于研究酸和碱之间的化学反应，测定其之间的等量点以及计算出物质的摩尔浓度。
本文将介绍酸碱中和实验的步骤和原理，以及实验中可能遇到的问题和解决方法。
一、实验步骤1. 准备实验器材和试剂：实验器材：烧杯、滴定管、酸碱指示剂、容量瓶等；试剂：酸和碱的溶液，一般选取浓度适中的酸和碱。
2. 预处理实验器材：使用洗涤剂洗净实验器材，用蒸馏水冲洗干净后晾干。
3. 配制溶液：a) 使用容量瓶准确地量取一定体积的酸和碱溶液；b) 分别将酸和碱溶液倒入两个干净的烧杯中。
4. 加入酸碱指示剂：在酸碱溶液中加入几滴酸碱指示剂，通常用酚酞或溴酚蓝。
5. 滴定：a) 用滴定管从酸溶液中取少量滴定液，滴入碱溶液中；b) 每滴加入一滴，同时轻轻搅拌溶液，直到颜色发生明显变化；c) 记录滴定的滴数。
6. 结果计算：根据滴定的滴数和酸碱溶液的浓度，可以计算出反应的摩尔比例和物质的摩尔浓度。
二、实验原理酸碱中和反应是一种酸和碱分子之间相互中和的化学反应。
在酸碱中和实验中，滴定是最常用的方法，可以通过滴定的滴数确定酸碱溶液的摩尔比例，从而计算出其摩尔浓度。
滴定实验中的酸碱指示剂是起到指示酸碱等量点的作用。
酸碱指示剂有选择性地发生颜色变化，当酸溶液和碱溶液完全中和时，酸碱指示剂的颜色也发生改变，标志着反应的等量点。
实验中，滴定液的添加量要控制得当，以免过量或不足，影响实验结果的准确性。
需要根据实验所使用的酸碱溶液的浓度进行适当的取滴，以保证实验的可靠性。
三、实验注意事项及问题解决方法1. 仪器和容器应洁净无杂质，以免影响实验结果；解决方法：洗涤剂清洗和蒸馏水冲洗，确保无杂质。
2. 滴定过程中要轻轻搅拌溶液，以保证反应均匀进行；解决方法：使用玻璃棒轻轻搅拌溶液。
3. 滴定液加入过多或不足，会导致实验结果的不准确；解决方法：滴定液加入过多时，可以再滴加酸或碱溶液至颜色变化明显，再次记录滴定液的滴数。
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（二）原理
• 特异的抗病毒免疫血清（中和抗体）和病 毒作用后，使病毒失去感染的能力，一种 病毒只能被相应的免疫血清所中和。 • 中和一定量的病毒的感染力必须有一定效 价的中和抗体。
（三）方法
1.中和实验验可分为体内试验和体外试验
体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接 种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻 击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫 苗免疫原Antibodies can neutralize viral infectivity in a number of ways, as summarized in the illustration. They may interfere with virion binding to receptors, block uptake into cells, prevent uncoating of the genomes in endosomes, or cause aggregation of virus particles. Many enveloped viruses are lysed when antiviral antibodies and serum complement disrupt membranes.
补充
• 病毒感染细胞的判断 判断细胞被病毒感染的方法最直接的就 是CPE（cytopathic effect），此外还有细 胞内病毒蛋白的免疫印迹；非特异的化学 方法如病毒感染导致细胞死亡MTT法。
参考文献
[1]A rapid microneutralization assay for cytomegalovirus Journal of Virological Methods, 14 (1986) 37-41 [2] A rapid microneutralization assay for the measurement of neutralizing antibody reactive with human cytomegalovirus Journal of Virological Methods, 23 (1989) 157-168 [3] Effect of Previous or Simultaneous Immunization with Canarypox Expressing Cytomegalovirus (CMV) Glycoprotein B (gB) on Response to Subunit gB Vaccine plus MF59 in Healthy CMV-Seronegative Adults [4] Rapid Quantitation of Cytomegalovirus and Assay of Neutralizing Antibody by Using Monoclonal Antibody to the Major Immediate-Early Viral Protein JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 1988, p. 504-507
抗HCMV IE单抗的出现促进酶联免疫法在HCMV 中和抗体效价检测中的应用，一些新型快速微量 中和试验相继建立，但结果需通过人工计数，检 测通量不高，本实验使用CCD进行图像采集和克 隆计数软件分析和计算，结果准确客观 本实验参照酶联免疫斑点法（ELISPOT），并使 用生物素-亲和素系统对信号进行放大，灵敏度有 所提高。 反应在96孔板中进行，样品用量仅为25μl，节约 成本。 无需昂贵的荧光显微镜，不受荧光信号容易淬灭 影响。
疫苗或抗血清
适量病毒
一定时间
致死状态等 判断结果
体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条 件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚以 检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差 异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指 数，即中和抗体的效价。
2.根据稀释成分不同可分为两种方法。一为固定病
毒用量与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试 验，以血清中和抗体滴度表示。二为固定血清用 量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。 结果以中和指数表示。
通常滴定终点的判断还需要有经验，不同 操作者之间主观因素影响较大。 CPE只能在细胞水平反映病毒的感染状态 ，对于病毒是否进入细胞（中和抗体主要 作用是在病毒吸附和侵入阶段阻断病毒感 染），感染进程无法体现。
（六）发展趋势
中和试验自出现以来，一直在朝着快 速，准确，微量，重复性好等目标发展。 先后出现了，噬斑减少中和试验（PRNT） ,快速微量中和试验等。随着各种病毒感染 细胞周期事件的阐明，各种针对病毒蛋白 的单克隆抗体研制工艺的成熟。利用酶联 免疫检测病毒是否进入细胞，比以往的出 现CPE才认为是病毒进入细胞更准确，更 快速。而且能从分子水平反映细胞的实际 感染状态。
固定血清稀释病毒法：
已知效价的抗血清 （通常为阴性对照）
测定
未知效价的抗血清
结果以中和 指数表示
试验组LD50 (EID50、TCID50) 中和指数 = ────────────────── 对照组LD50 (EID50、TCID50)
固定病毒稀释血清法：
已知效价（滴度） 的病毒
测定
抗血清的效价
步骤二
25μ l病毒
25μ l病毒
25μ l维持液
步骤三
50μ l混合液
50μ l混合液
50μ l混合液
图3.感染HCMV 的MRC-5 细胞的 体视显微镜（B，× 25）图像
本实验的优点体现在以下几个方面
HCMV感染普遍存在，不管是患者血清学检 查或是开发HCMV特异中和抗体产品（如杂交瘤细 胞产中和抗体的检测或是成品的质控），快速准 确的测定样品中中和抗体效价都是关键。以往运 用普通的中和试验，观察典型CPE出现，需要6-7 天才能得出结果，离实际需要相差很远。 本实验采用96孔板里做酶联免疫检测病毒IE1 基因的表达，来确定病毒是否被中和抗体所中和 ，检测结果可在两天内读出。
以HCMV中和抗体效价测定为例
2倍稀释血清样 品，终体积 0.2ml 200PFU HCMV每孔 0.2ml 孵育1h
加到
24孔板中以长 成单层MRC-5 细胞
37℃孵育1h
弃去液体， PBS洗三 次
含0.3%琼脂的 维持液覆盖
3-5天再次覆盖
14天甲醛 固定
甲基蓝染色
中和抗体效价 的测定
同时设病毒对照和细胞对照，病 毒对照组只加病毒不加血清，细胞对 照组用维持液代替血清和病毒。 病毒对照组细胞全部病变 （100%），细胞对照组不出现噬斑。
结果以血清中 中和抗体滴度表示
(四) 应用
1.蚀斑减少中和实验（Plaque Reduction Neutralization Test PRNT）
蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种 敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少 50％的血 清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒（ 100PFU）与不同稀释度的等量血清混合后感作,接 种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃ 二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用 Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。
4.病毒的中和抗体（neutralization antibody ）指：针对病毒某些表面抗原的抗体，此类 抗体能与细胞外游离的病毒结合从而消除病 毒的感染能力。 5.中和抗体的作用机制：
①直接封闭病毒表面抗原，如与病 毒表面吸附蛋白（VAP）结合，从 而阻断病毒的吸附
②改变病毒表面结构
③病毒与中和抗体形成的免疫复 合物，易被巨噬细胞吞噬清除 ④有包膜的病毒表面抗原与中和 抗体结合后，激活补体，可导致 病毒的裂解
（五）各种方法利弊分析
体内试验能够更加真实的反映病毒和抗血 清在体内的作用状态。然而试验成本较高 ，而且实验受动物个体间免疫力差异影响 较大，实验结果不稳定，重复性也不如体 外实验。 中和试验滴定终点的判断通常以半数致死 剂量LD50（体内实验）或是半数致细胞病 变剂量CCID50为指标。然而很多病毒感染 敏感细胞并不出现典型的CPE或是CPE出 现比较晚，无法满足临床上需快速及时监 测患者血清学状态的要求。
（七）质量控制
因目前尚无CMV中和抗体的国家标准品，该方法的准确性无 法验证，下面分别对精密性，耐用性和专属性进行验证。 ① 精密性验证 重复性验证 对同一份CMV-IVIG样品在同一次试验中平行检测12次，计 算变异系数（CV） CV=σ/μ σ为方差，μ为平均值 中间精密性验证 A：不同操作者对同一份样品分别检测三次 B：同一操作者不同工作日对同一份样品检测三次 分别计算CV
实验流程
血清灭活
56℃ 30分钟，不同来源的 血清灭火温度和时间可能 不同
步 骤 一
用维持液2倍稀释血清 每孔终体积25μl
步 骤 二
与等体积已知滴度的 病毒混合，37℃ 中和不同时间
45min 60min 75min 90min
动物血清中，含有多种蛋 白质成分对抗体中和病毒 有辅助作用，如补体、免 疫球蛋白和抗补体抗体等。 为排除这些不耐热的非特 异性反应因素，用于中和 试验的血清须经加热灭活 处理。
6.病毒中和试验：Neutralization of a virus is defined as the loss of infectivity through reaction of the virus with specific antibody. • 以测定病毒感染力为基础，以病毒受免疫 血清中和后残存的感染力为依据，来判定 免疫血清中和病毒的能力。 • 常用于检测患者血清中抗体消长情况，抗 原免疫原性评价，也可用来鉴定未知病毒 或对病毒进行半定量等。
病毒中和试验 Virus Neutralization Test
2012.7.17 张文昌
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