pESC-Leu酵母表达载体
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
颍上新城质差室分分析案例摘要：随着VOLTE百日大会战的开启，我部对阜阳质差室分进行摸排分析，目前质差室分原因主要为馈线问题、室分泄漏、宏站与室分切换等，针对不同原因，采用工程维护、RF及工参优化等手段进行改善。
关键字：馈线问题、室分泄漏、工程维护、RF及工参优化【故障现象】：3月上旬，发现该XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3小区室分MR 覆盖率仅为90.1%，该室分覆盖东西两栋30层高层，其中1-4F为商场部分，未做室分覆盖，采样点较少。
【原因分析】：此类室分质差主要从以下几点分析原因：（1）是否存在告警及馈线驻波告警；（2）室分泄漏；（3）室内外切换重选参数是否合理；（4）馈线故障。
1.原因排查：（1）对该小区进行告警排查及驻波测试，无异常，驻波均值正常值范围内,如下图所示：（2）针对是否存在室内泄漏，对该小区周边楼宇进行测试，周边楼宇主要占用的信号为1.8G宏站FY-颍上-鑫都华庭-HFTA-437970-61、FY-颍上-颍上荣禾绿园-HFMA-436418-55。
XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3主要为平层覆盖，为发现室分泄漏。
（3）对颍上新城进行室内摸排，测试过程中，主要占用为室分信号，切换无异常，该楼宇室分覆盖如下所示：根据设计图纸及网管资料，该室分系统主要覆盖东西两单元30F及地下车库，现场摸排中发现，RSRP均值为 -75dbm，SINR均值为28dbm，室分整体覆盖良好，其中东西单元1-4F电梯室分覆盖效果较差，平均RSRP均值为-108dbm，SINR均值为2dbm，西单元的10-11F主要为宏站信号，该层怀疑为室分馈线故障导致，如下所示：并且根据设计图纸，该楼宇存在地下停车场，对该区域进行测试，发现，由于纠纷问题，原覆盖新城1-4F的商场部分的XY-FY-颍上-御水兰庭-HFTA-437017-2室分，未能覆盖该区域，该设备位于负一层电梯口附近的弱电井，设备AB口为临时接的蘑菇头，该设备只能覆盖电梯口至地下停车场之间走廊的部分区域，剩余区域则为弱覆盖区域，主要占用信号为为地下停车XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3室分覆盖，平均RSRP均值为-105dbm，SINR均值为6dbm。
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍
毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。
整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。
在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。
为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。
表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。
有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。
一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。
携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。
甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。
对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。
因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。
在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。
这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。
如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。
酵母表达载体的构件
各个外显子
终止密码子
真核基因的一般结构
真核生物基因表达过程示意图
真核生物基因的结构特点
真核生物结构基因示意图
可见，真核生物基因的转录和翻译具有时间 和空间上的分隔。上述真核生物基因转录后 的剪切、拼接和转移等过程，都需要有调控 序列的调控，这种调控作用是原核生物所没 有的。
产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋
白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌
是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
真核基因在大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含 有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞 中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分 子，并把它们降解掉。
统，需要构建不同的表达载体。克隆基因在不同的系
统中表达成功的把握性，取决于我们对这些系统中宿
主基因表达调控规律的认识程度。
人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背
景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖
快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工
具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因
第十一章
克隆基因在真核生物中的表达
真核表达系统是指利用真核生物细胞作为外源基因 表达宿主的一类基因表达系统，常用的真核系统包 括酵母、丝状真菌、昆虫类、植物和哺乳动物细胞 等表达系统。 本章主要是关于酵母表达系统。
酵母表达系统步骤
毕赤酵母表达系统步骤（参考Invitrogen公司说明书）：一、pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存1取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。
2挑取转化子，甘油保存。
二、载体构建1将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。
2提质粒酶切鉴定或PCR鉴定3载体测序测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物三、线性化DNA1提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒）2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全；4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）；四、线性化DNA的去磷酸化处理线性化质粒43μlCIAP Buffer 5μlCIAP酶2μl四、总体积为50μl的样品37℃ 1h，过柱纯化，用30μl ddH2O洗脱；五、感受态细胞的制备实验前准备：无抗性YPD平板一个、无抗生素液体YPD培养基，100μg/ml Zeocin YPD 平板和液体、50ml离心管两个、500ml预冷的无菌水、20ml 1M 山梨醇（灭菌预冷的），0.2cm预冷的电击杯；1YPD平板划线培养菌，30℃培养2-3d；250ml三角瓶中，加入5ml YPD，挑取酵母单菌落，30℃培养过夜；3吸取0.5ml菌液，加入至含有200ml新鲜YPD的1L三角瓶中，30℃，225rpm/min培养至OD值1.3-1.5；41500g，4℃离心5min收集菌体；540ml冰预冷的无菌水重悬沉淀；61500g，4℃,5min；730ml无菌水重悬；81500g，4℃,5min；910ml 1M 山梨醇重悬；101500g，4℃,5min；11加入1ml山梨醇，重悬冰上放置，直接做转化，或加入灭菌甘油每管80ul分装，冻存于-80℃(长时间保存会影响转化效率)；六、电击转化15-10μg线性化DNA（20μl<）与80ul上述感受态细胞混合，转移至预冷的0.2cm电击杯中（点击条件：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω，电击时间为4～10msec）；2冰上放置5min3电击（按生产厂商提供的适合酵母用的参数）4迅速加入1ml预冷的1M 山梨醇，转移至1.5ml EP管中530℃静置培养1-2h（如果要增加存活率，获得更多的转化克隆，可在30℃静置培养1h后，加入1mlYPD培养基，30℃200rpm培养1h后取部分涂布与不同浓度抗生素的平板）6取50、100、200ul分别涂布于含有Zeocin的YPD平板，30℃培养2-10 d至有菌落出现；7如果要筛选多拷贝转化子，将转化克隆混合在一起，涂布在Zeocin 浓度为500、1000、2000μg/ml的YPD平板，培养2-3d。
毕赤酵母蛋白表达载体是什么？
毕赤酵母蛋白表达载体是什么？
毕赤酵母重组蛋白表达载体系统有着非常强大高效的重组蛋白表达能力。
毕赤酵母作为一种甲基营养型酵母，被广泛应用在蛋白产品的研究和工业应用上。
在该载体系统中，目的基因通常被克隆在甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GAP）和乙醇氧化酶1启动子（AOX1）的下游，这取决于基因的基本结构和表达诱导条件的要求。
GAP是一个强大的组成型启动子，而AOX1则是受甲醇严格高效调控的启动子，这两个启动子都能够介导目的基因的高水平表达，目的蛋白的累加总量往往可达总细胞可溶性蛋白的30%以上。
一般来说，GAP启动子的表达能力略强于诱导状态下的AOX1启动子。
建议您做一个时间曲线测试，以确定表达目的蛋白的最佳启动子类型。
与酿酒酵母不同的是，毕赤酵母以甲醇为基础碳源，能更高水平地介导重组蛋白的表达（通常是酿酒酵母的的10-100倍）。
另外，毕赤酵母和酿酒酵母在技术上有许多共通之处（如互补作用），通用的基因注释和遗传命名法简化了两个物种的研究。
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酵母表达体系
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶.而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子.毕赤酵母含有两种醇氧化物酶,AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。
AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白:分泌型和胞内表达.利用含有α因子序列的分泌型载体即可.翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型,毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基)短得多。
菌株：GS115 （ Mut+， Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体：pPICZα A，B,and C（5’AOX1启动子，紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签)胞内表达型载体:pPICZ A，B，and C,一：分子克隆1。
设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C）2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer(10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlO up to 50μlddH2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
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pESC-Leu编号 载体名称北京华越洋生物VECT3040 pESC-‐Leu载体基本信息出品公司: Agilent 安捷伦载体名称: pESC-‐Leu, p ESC L eu质粒类型: 酿酒酵母蛋白表达载体表达水平: 高拷贝诱导方法: 半乳糖启动子: GAL1和GAL10克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 7758 b p5' 测序引物及序列: GAL1-‐F: A TTTTCGGTTTGTATTACTTC; GAL10-‐F: G GTGGTAATGCCATGTAATATG3' 测序引物及序列: GALI-‐R: G TTCTTAATACTAACATAACT GAL10-‐R: G GCAAGGTAGACAAGCCGACAAC载体标签: C-‐Flag, C-‐Myc载体抗性: 氨苄筛选标记: Leu2备注: 利用半乳糖诱导，可以同时使两个基因在酿酒酵母中表达。
产品目录号: 217452稳定性: 稳定 Stable组成型/诱导型: 诱导型病毒/非病毒: 非病毒载体质粒图谱和多克隆位点信息pESC-‐Leu多克隆位点载体序列LOCUS pESC-LEU 7758 bp DNA circular SYN ORIGIN1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 61 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 121 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 181 accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc 241 accattatgg gaaatgcttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca 301 ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat 361 taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc 421 ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc cattagtatc 481 aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt 541 agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg 601 tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct 661 ttttaagcaa ggattttctt aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg 721 ttggaaccac ctaaatcacc 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tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 5821 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 5881 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 5941 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 6001 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 6061 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 6121 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 6181 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 6241 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 6301 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgaac gaagcatctg 6361 tgcttcattt tgtagaacaa aaatgcaacg cgagagcgct aatttttcaa acaaagaatc 6421 tgagctgcat ttttacagaa cagaaatgca acgcgaaagc gctattttac caacgaagaa 6481 tctgtgcttc atttttgtaa aacaaaaatg caacgcgaga gcgctaattt ttcaaacaaa 6541 gaatctgagc tgcattttta cagaacagaa atgcaacgcg agagcgctat tttaccaaca 6601 aagaatctat acttcttttt tgttctacaa aaatgcatcc cgagagcgct atttttctaa 6661 caaagcatct tagattactt tttttctcct ttgtgcgctc tataatgcag tctcttgata 6721 actttttgca ctgtaggtcc gttaaggtta gaagaaggct actttggtgt ctattttctc 6781 ttccataaaa aaagcctgac tccacttccc gcgtttactg attactagcg aagctgcggg 6841 tgcatttttt caagataaag gcatccccga ttatattcta taccgatgtg gattgcgcat 6901 actttgtgaa cagaaagtga tagcgttgat gattcttcat tggtcagaaa attatgaacg6961 gtttcttcta ttttgtctct atatactacg tataggaaat gtttacattt tcgtattgtt 7021 ttcgattcac tctatgaata gttcttacta caattttttt gtctaaagag taatactaga 7081 gataaacata aaaaatgtag aggtcgagtt tagatgcaag ttcaaggagc gaaaggtgga 7141 tgggtaggtt atatagggat atagcacaga gatatatagc aaagagatac ttttgagcaa 7201 tgtttgtgga agcggtattc gcaatatttt agtagctcgt tacagtccgg tgcgtttttg 7261 gttttttgaa agtgcgtctt cagagcgctt ttggttttca aaagcgctct gaagttccta 7321 tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa agcgtttccg aaaacgagcg 7381 cttccgaaaa tgcaacgcga gctgcgcaca tacagctcac tgttcacgtc gcacctatat 7441 ctgcgtgttg cctgtatata tatatacatg agaagaacgg catagtgcgt gtttatgctt 7501 aaatgcgtac ttatatgcgt ctatttatgt aggatgaaag gtagtctagt acctcctgtg 7561 atattatccc attccatgcg gggtatcgta tgcttccttc agcactaccc tttagctgtt 7621 ctatatgctg ccactcctca attggattag tctcatcctt caatgctatc atttcctttg 7681 atattggatc atactaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta 7741 tcacgaggcc ctttcgtc//其他酵母表达载体：pPIC3.5 Ycplac33 Ycplac33 pPICZ αC pPICZ αD pPICZ αD pHIL-S1 pYES2 pYES2 pMETA pDR195 pDR195 pMET αB pYIP5 pYIP5 pYES2-NTC pADH2 pADH2 pESC-Leu pFLD αpFLD αpPICZ αB pGBKT7-53 pGBKT7-53 pYES2-kan pSos pSos pYIP211 pCL1pCL1 pYC2/NTBpYES2-NTB pGAPZ αC pAD-GAL4-2.1 pYES6/CT pPink-LC pGAPZA pESC-URA pMET αA pPIC9 pYRP7pYES2-NTA pPICZB pYEPlac112 pESC-His pSEP2 pPICZ αFC pFLD/CAT pRS414 pPICZApACT2-AD pRS405 pPIC9k-His pBridge pPIC6αB pYES2-EGFP pSos-MAFB pPIC6C pPICZC p53blue pHIL-D2 pAUR123 pRS406 pMETB pPIC3.5K pPIC6αA pMET αC pPink α-HC pPIC6B pYES3/CT pDisplay pYC2/CT pESC-TRP pGBKT7-Lam pPICZ αA pRS426 pMyrpGAPZB pYCP211 pHisSi-1 pPIC9K p416GFD pSEP1 pGAPZ αB pRS426gal pRS416 pPink-HC pHIC-PI pHis2 pMETC pRS316 pGADT7-T pUG66pRS41H pGAG424 SUMO protease pYX212pSEP3 Ycp22lac-EGFP pYEPlac195 pRS415 pFLD pPICZ αGB pRS403 pGBKT7pGADT7-T pPIC6αCpFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pDEST32pYES-DEST52pYC2/NTA。