pPIC9k-His酵母表达载体说明
毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
pDR195酵母表达载体说明
pDR195编号 载体名称北京华越洋生物VECT2970 pDR195载体基本信息出品公司: Addgene载体名称: pDR195质粒类型: 酵母菌表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: PMA1克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6318bp5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: Ampicillin筛选标记: URA3备注: -‐-‐产品目录号: 36028稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 非病毒载体质粒图谱和多克隆位点信息载体序列ORIGIN1 cccagcctcg agcggccgcg cggatccagc tttggacttc ttcgccagag gtttggtcaa 61 gtctccaatc aaggttgtcg gcttgtctac cttgccagaa atttacgaaa agatggaaaa 121 gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga cacttctaaa taagcgaatt tcttatgatt 181 tatgattttt attattaaat aagttataaa aaaaataagt gtatacaaat tttaaagtga 241 ctcttaggtt ttaaaacgar aattcttatt cttgagtaac tctttcctgt aggtcaggtt 301 gctttctcag gtatagcatg aggtcgctct tattgaccac acctctaccg gcatgccaat 361 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 421 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 481 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 541 cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc ataatcggat cgtacttgtt acccatcatt 601 gaattttgaa catccgaacc 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pESC-URA pPinkα-HC pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pRS316 pFLD pRS403 pFLD/CAT pRS405 pFLDαpRS406 pGADT7-T pRS414 pGAG424 pRS415 pGAPZA pRS416 pGAPZB pRS41H pGAPZαB pRS426 pGAPZαC pRS426gal pGBKT7 pSEP1 pGBKT7-53 pSEP2 pGBKT7-Lam pSEP3pHIC-PI pSospHIL-D2 pSos-MAFB pHIL-S1 pUG66pHis2 pYC2/CT pHisSi-1 pYC2/NTA pMETA pYC2/NTB pMETB pYCP211 pMETC pYEPlac112 pMETαA pYEPlac195 pMETαB pYES2pMETαC pYES2-EGFP pMyr pYES2-kan pPIC3.5 pYES2-NTA pPIC3.5K pYES2-NTB pPIC6B pYES2-NTC pPIC6C pYES3/CT pPIC6αA pYES6/CT pPIC6αB pYES-DEST52 pPIC6αC pYIP211 pYX212 pYIP5 SUMOprotease pYRP7Ycp22lac-EGFP Ycplac33。
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
酵母表达系统所需实验材料
一、菌种1.大肠杆菌一种克隆感受态（JM109，DH5α，TG1，TOP10）2.毕赤酵母菌.GS115,甲醇利用正表型(Mu+)。
培养基含有甲醇时，菌正常生长，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子中，Mu+和Muts两种表型都有，需要在MM 和MD培养基上鉴定表型，转化整合效率高。
KM71H, 甲醇利用慢表型(Muts)。
培养基含有甲醇时，菌生长比野生株缓慢，组表达载体转化KM71H后，长出的转化子中，都是Muts表型，不需Mu表型鉴定。
SMD1168(Mu+)，蛋白酶缺陷型宿主菌，降低了目的蛋白被蛋白水解酶降解的风险。
二、毕赤酵母菌分泌表达载体诱导型启动子：pPIC9K，采用α因子信号序列，含卡那抗性基因，可用遗传霉素筛选外源基因多拷贝转化子。
（无标签）pPICZαA，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。
（有标签）组成型启动子：pGAPZα，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。
（有标签）另外，大肠杆菌表达载体pCold也可以进行诱导分泌表达蛋白。
三、实验试剂限制性内切酶EcoRI，NotI，NcoI，Sac I，T4DNA连接酶，Takara公司G418（遗传霉素），葡萄糖，生物素，甲醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203，酵母氮源(YNB)，含His的补充培养基，酵母基因组DNA纯化试剂盒，大肠杆菌质粒提取试剂盒，0.2μm无菌滤膜。
四、实验简要计划用软件对pET28a-重组人胰岛素质粒进行EcoRI，NotI，NcoI酶切位点分析发现，NotI 在NcoI位点的上游，并且都是单酶切位点。
所以可以通过EcoRI和NotI对重组大肠杆菌质粒双酶切获取目的基因，这对目的基因的阅读框无影响。
通过EcoRI和NotI对酵母表达载体双酶切，可以获得载体片段。
将获得的载体片段与目的基因用T4 DNA连接酶4摄氏度连接过夜，并转化到大肠杆菌克隆感受态中，在抗生素培养基中培养，提取质粒进行酶切及PCR鉴定正确后，送去测序。
弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定
弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定谢荣华;吴翔;舒衡平;蒋立平;范久波;谭逵;张琼【期刊名称】《中国病原生物学杂志》【年(卷),期】2007(2)2【摘要】目的构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础。
方法PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。
结果特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573 bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框。
结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒。
【总页数】3页(P115-117)【关键词】刚地弓形虫;GRA1;酵母表达质粒;构建;鉴定【作者】谢荣华;吴翔;舒衡平;蒋立平;范久波;谭逵;张琼【作者单位】中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室【正文语种】中文【中图分类】R382.5【相关文献】1.弓形虫GRA 3基因真核表达质粒的构建与鉴定 [J], 薛书江;张守发;栾杨2.弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定 [J], 陈镭;李成朋;陈弟;赵徐寒晖;蒋凯;林佳鑫;刘阳阳;胡昕;谭峰3.弓形虫真核表达质粒pcDNA3/wx2的构建与鉴定 [J], 吴翔;汪世平;舒衡平;谭逵;张琼4.弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅰ.pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒的构建及鉴定 [J], 王丹静;舒衡平;蔡力汀;吴翔;蒋立平5.VP22与EGFP、3种弓形虫抗原融合表达重组质粒的构建与鉴定 [J], 王娜;刘彦双;刘宁;金超;张喜路;金月;薛书江因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒三叶虫(2007-4-25 13:59:55) 点击:75 回复:0 IP:60.216.104.*制作者：陈苗商汉桥毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3 等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1 及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1 基因已被分离，含AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
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其他酵母表达载体：
p416GFD p53blue pACT2-AD pAD-GAL4-2.1 pADH2 pAUR123 pBridge pCL1 pDEST32 pDisplay pDR195 pESC-His pESC-Leu pESC-TRP pESC-URA pFA6a-FGP(S65T)-kanMX6 pFLD pFLD/CAT pFLDα pGADT7-T pGAG424 pGAPZA pGAPZB pGAPZαB pGAPZαC pGBKT7 pGBKT7-53 pGBKT7-Lam pHIC-PI pHIL-D2 pHIL-S1 pHis2 pHisSi-1 pPIC9 pPIC9K pPIC9k-His pPICZA pPICZB pPICZC pPICZαA pPICZαB pPICZαC pPICZαD pPICZαFC pPICZαGB pPink-HC pPink-LC pPinkα-HC pRS316 pRS403 pRS405 pRS406 pRS414 pRS415 pRS416 pRS41H pRS426 pRS426gal pSEP1 pSEP2 pSEP3 pSos pSos-MAFB pUG66 pYC2/CT pYC2/NTA
载体名称
pPIC9k-‐His
Invitrogen pPIC9k-‐His 酵母表达载体 -‐-‐ -‐-‐ 多克隆位点，限制性内切酶 -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ Ampicillin -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐
pMETA pMETB pMETC pMETαA pMETαB pMETαC pMyr pPIC3.5 pPIC3.5K pPIC6B pPIC6C pPIC6αA pPIC6αB pPIC6αC pYX212 SUMOprotease Ycp22lac-EGFP
pYC2/NTB pYCP211 pYEPlac112 pYEPlac195 pYES2 pYES2-EGFP pYES2-kan pYES2-NTA pYES2-NTB pYES2-NTC pYES3/CT pYES6/CT pYES-DEST52 pYIP211 pYIP5 pYRP7 Ycplac33
pPIC9k-His
编号
北京华越洋生物 VECT2430 载体基本信息 出品公司 : 载体名称 : 质粒类型 : 高拷贝 /低拷贝 : 启动子 : ห้องสมุดไป่ตู้隆方法 : 载体大小 : 5' 测序引物及序列 : 3' 测序引物及序列 : 载体标签 : 载体抗性 : 筛选标记 : 备注 : 产品目录号 : 稳定性 : 组成型 : 病毒 /非病毒 : 载体质粒图谱和多克隆位点信息