上海市结核病实验诊断操作规程 共74页
结核病的实验室诊断技术及应用PPT课件
不能区分某些非结核分枝杆菌（堪萨斯、苏氏、戈登、海 分枝杆菌）
操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群，
可ห้องสมุดไป่ตู้存在假阴性。
能否疗效监测？——无大量数据
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三、结核DNA检测技术
• 测序——金标准 • 荧光定量 PCR • 环介导恒温扩增法（LAMP） • 基因芯片检测鉴定技术 • 基因Xpert MTB/RIF检测技术
M smegmatis
M szulgai M terrae M vaccae M xenopi
抗原
ESAT6
+ + + + -
CFP-10
+ + + + -
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准确—T-SPOT临床诊断性能
• 特异性
阴性预测值：93.9%（478/509） 阳性预测值：95.4%（624/654）
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（ BCG）无交叉反应
过夜孵育，洗板，加入酶标二抗
加入显色液，观察结果
1个斑点=1个效应T细胞
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实验效果图
阴性结果
空白对照
抗原A ESAT-6
抗原B CFP10
阳性对照 （PHA）
阳性结果
=
一 个 斑 点 一 个 结 核 效 应 淋 巴 细 胞
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T-SPOT结果的解读-阳性结果
• 活动性结核病 — 典型结核中毒症状
• 国内风湿科和消化科已列入专家共识
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快速—T-SPOT的实验步骤
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周 血单个核细胞
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激 结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ干扰素
结核杆菌培养标准操作流程
灭菌处理
将处理后的样本进行灭菌处理，以消除杂菌干扰。
培养基制备
选择培养基
选择适合结核杆菌生长的 培养基，如罗氏培养基、 改良罗氏培养基等。
制备方法
按照培养基说明书，准确 称量、溶解、调节pH值等 步骤制备培养基。
灭菌处理
将制备好的培养基进行高 温高压灭菌，以确保无菌 状态。
结核杆菌培养的重要性
诊断价值
结核杆菌培养能够直接获得病原 菌，对于确诊结核病具有重要的
价值。
指导治疗
通过结核杆菌培养和药敏试验，可 以了解病原菌的耐药性，为临床医 生制定合理的治疗方案提供依据。
流行病学调查
结核杆菌培养还可以用于流行病学 调查，了解结核病的传播情况和菌 株的分布特点。
02
结核杆菌培养标准操作流程
02
实验室内应建立完善的质量控制体系，对实验过程和结果进行
监控和评估。
实验人员应定期参加培训和考核，提高专业技能和素质，确保
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实验质量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
04
结核杆菌培养的应用
结核病的诊断
结核病是一种由结核杆菌引起的慢性传染病，常常侵犯肺部，但也可影响其他器官。 结核杆菌培养是诊断结核病的重要手段之一，通过培养出结核杆菌可确诊结核病。
感谢观看
结核杆菌培养标准操作流 程
• 引言 • 结核杆菌培养标准操作流程 • 注意事项 • 结核杆菌培养的应用 • 结论
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引言
目的和背景
目的
结核杆菌培养是诊断结核病的重要手段，通过培养可以获得结核杆菌的纯培养 物，用于后续的菌种鉴定、药敏试验等。
背景
结核病是一种由结核杆菌引起的慢性传染病，对人类的健康造成了严重的威胁。 随着耐药结核病的增多，结核杆菌培养成为了临床诊断和治疗的关键环节。
结核病实验室诊断ppt课件
结核病细菌学实验室 在国家结核病控制规划（NTP)中 起到举足轻重的作用
应当得到各级政府、领导和有关单位 的高度重视！
分枝杆菌生物学概述
分枝杆菌属裂殖菌纲，放线菌目，种类甚多，目前已命名
的有50多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。
结核分枝杆菌是1882年郭霍（Robert Koch）从肺结核
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置37C温 箱培养
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养阳 性率较高；
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟，否则 影响阳性率；
涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产生气溶 胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方可报告 阳性。
细 胞 质
是带粘滞性的液体，充满了细胞膜内的整
个空间。 细胞浆内含有核糖体及其他多种颗粒。 功能： 细胞合成蛋白质和核酸等生命活性物质 的 场所 细菌对营养物质进行同化作用和异化作 用的场所
核 质
由单一双股DNA组成。 电镜下由极细的纤维物质所组成，
与细胞质不分开，无核膜、核仁。
操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；
快速，数小时可报告结果。
痰涂片镜检的缺点
敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌 才可得到阳性结果； 特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不能区分结 核和非结核分枝杆菌； 镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。
分离培养的重要意义
革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌为淡兰 色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光染色镜下的 抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。
抗 酸 性
分枝杆菌不易着色，一旦着色可以抵抗盐酸酒精的脱色， 称为“抗酸性”。 抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的 细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。
结核病实验室诊断技术PPT课件
结核病实验室诊断技术
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结核病 — 全球的公共健康问题（2018报告）
全球范围内，结核病是导致死亡的十大原因之一，每年有数百万人患上结核病。2017年， HIV阴性人群中，结核病导致约157万人死亡;而且在HIV阳性人群中，也有30万人死于结核。 2017年，估计有1000万人新感染结核:中国估计有88.9万人新感染结核。
• 菌株是革兰氏阳性菌，很难被染色，有 些甚至不能被染色，细胞壁含60%脂质， 一般用萋尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
• 棒状，无运动能力，专性需氧 • 生长缓慢 • 每16-20小时分裂一代，需4-6周才能长成
菌落。 由于结核分枝杆菌的遗传特性决定其生长
周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵 敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素 较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发 展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。
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抗原MPT-64
耐多药 泛耐药
细菌学检查
• 结核病人的细菌学检查不8 仅是发现传染源的主 要途径和手段，也是结核病确诊和制订化疗方 案，考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。
• 涂片法 抗酸染色 荧光染色 液基夹层杯
• 培养法 改良罗氏培养 液体培养（BD960)
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细菌学检查-涂片法
抗酸染色
总体而言，90%的结核患者是成年人(≥15岁);9%同时伴随HIV感染(其中有72%是在非洲); 三分之二的结核患者来自8个国家:印度(27%)、中国(9%)、印度尼西亚(8%)、菲律宾(6%)、 巴基斯坦(5%)、尼日利亚(4%)、孟加拉国(4%)和南非(3%)。全球病例中只有6%出现在欧洲 地区(3%)和美洲地区(3%)。
结核杆菌涂片检查标准操作程序
SOP_15-16 结核杆菌涂片检查标准操作程序一、目的：统一项目操作规程，严格检验质量标准，为临床提供及时、可靠的结果报告。
二、适用范围：结核杆菌涂片检查三、操作人员：检验科授权工作人员四、操作步骤：1、原理抗酸染色的基本原理是抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状。
此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性乙醇脱色，显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性乙醇脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。
2、染色液的配制2.1碳酸复红染液：全省统一配送2.2 5%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸5mL与95%乙醇混合2.3亚亚甲蓝染色液：全省统一配送3、载玻片的准备：用于AFB检查的载玻片要求：⑴一张载玻只能涂抹一份痰标本。
⑵每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查。
新的载玻片放入95%乙醇中浸泡2小时脱脂，用摄子夹出放干净纱布上阴干，放无尘容器（培养皿）中备用。
4、本的采集、运送及处理4.1初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、晨痰和即时痰）。
如无夜间痰，在留晨痰后2-3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。
疗程中或复诊随访病人按期每次送检2份痰（晨痰和夜间痰）。
痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。
4.2收集标本的容器应采用WHO推荐的标准痰瓶，或采用直径4厘米、高2厘米的可密封塑料盒或蜡纸盒（我省统一采用蜡纸盒）。
★痰容器上就注明与检验单一致的病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、★检查项目和容器序号1、2、3（1为当日即时痰，2为夜间痰。
3为晨痰）。
5、涂片的制备5.1 编号：取经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片背面左端1/3处注明实验室序号(56001递增)及标本序号（按1递增）（如使用的载玻片一端无磨砂面，须用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。
精选结核病的实验室诊断资料81页PPT
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
精选结核病的实验室诊断资料
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍
结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法）规程操作
结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法）规程操作结核分枝杆菌抗体检测(胶体金法) 规程操作1、检验目的本试剂盒可定性检测人血清中结构分枝杆菌抗体，用于临床结构病的辅助诊断。
2、检验原理本试剂盒利用斑点免疫胶体金渗滤技术（DIGFA），将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维素膜上，膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核IgG 抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物标呈色（SPA能与IgG 特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳结果从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。
3、样本要求必须使用新鲜血清标本，血浆标本必须用玻璃棒剥离纤维蛋白，保证血清无混浊沉淀。
4、试剂4.1试剂名称：结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法）4.2生产厂家：上海奥普生物医药有限公司4.3包装规格：20人份/盒4.4贮存条件及有效期：2-8℃干燥处保存，有效期12个月。
5、检验方法：5.1在反应板的反应孔中间，加入2滴封闭液，等待薄膜吸入；5.2 取40μl新鲜的血清标本，加入反应孔中间，等待薄膜吸入；5.3 在反应孔中间加入6滴洗活液，等待薄膜吸入；5.4 在反应孔中间加入2滴金标液，等待薄膜吸入；5.4 在反应孔中间加入6滴洗涤液，等待薄膜吸收，目测结果；6、结果判断6.1 阳性——质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现。
6.2 阴性——质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹。
检验方法的局限性少数标本（急性感染、高血脂、溶血等）可出现背景偏红，一般不影响结果判断，可通过将标本用封闭液1:3稀释，加样80μl背景将获得改善。
严重乳糜血标本可能会阻塞硝酸纤维素膜孔，使背景很红，影响中间红色斑点有无的判别，不宜用本法测定。
7、注意事项7.1 必须以单人份操作，严禁多标本同时检测，每个标本的操作步骤需要连续进行，不宜停顿过长。
7.2 质控点显示红色表明试剂盒有效；阴、阳性对照也是确保定性结果可靠的一个环节，但临床阳性标本显色深浅可以与阳性对照不同。
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非结核分枝杆菌与临床疾病的关系 结核病实验诊断操作规程
非结核分枝杆菌菌种 临床相关疾病
标本来源
脓肿分枝杆菌或鸟分枝 患有囊性纤维变性或
呼吸道
杆菌复合群（MAC） 支气管扩张的老年人
偶发分枝杆菌
食道贲门失弛缓症， 慢性
呼吸道
返流病，或矿物油摄入史
海分枝杆菌
有鱼缸或海水接触史的严重伤口 活检/抽吸物
堪萨斯分枝杆菌或MAC 毛细胞白血病，HIV感染史
结核病实验诊断操作规程
第一节 编写目的和应用范围
结核病实验诊断操作规程
根据我国的结核病防控体系，结核病的诊治工 作主要在定点医院内进行。
初次感染病人的症状往往不典型，存在轻症甚 至无症状的结核病，老年人的结核病症状容易 被其他疾病掩盖。这些病人的首诊医院往往不 是定点医院。
非定点医院的实验室人员一般未经过结核分枝 杆菌检验的正规培训和能力认可，操作规程、 方法和检测的能力各不相同，容易导致不正确 的检验结果，使结核病的漏诊、误诊率增加。
结核分枝杆菌细胞壁富含脂质，约占细胞壁的 60%，主要的成分是分枝菌酸和酸化海藻糖。前 者是抗酸染色反应的物质基础；后者包括海藻糖 双分枝菌酸和硫甘酸，分别具有介导肉芽肿形成 和保护细菌在吞噬细胞内存活的作用，被认为是 结核分枝杆菌的毒力因素。
三、检测分枝杆菌的临床意义 结核病实验诊断操作规程
决于吸入结核分枝杆菌的数量、毒力和个体的抵 抗力等多种因素。
二、结核分枝杆菌生物特性 结核病实验诊断操作规程
结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝 杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，引起人类 结核病的主要病原菌是结核分枝杆菌。
结核分枝杆菌大小为0.3-0.6m×1-4m，菌体 细长而略弯，两端略钝。抗酸染色阳性是其重要 特性。结核分枝杆菌生长缓慢，至少需要2-4周 才出现可见菌落。
缺点：进行LPAs试验仍需再做常规培养及DST。目 前注册使用的LPAs方法只适用于对涂片阴性培养阳 性或涂片阳性标本进行检测。
限制因素：LPAs适合在中心实验室/国家参比室开展 。如果地区实验室的基础设施能达到要求，也可考虑 开展实验。
结核病实验诊断操作规程
第三节 相关术语
相关术语
结核病实验诊断操作规程
结核病实验诊断操作规程
上海市结核病实验诊断操作规范
（适用于非定点综合性医院）
上海检验分会微生物学组
赵虎
主要内容
结核病实验诊断操作规程
结核病及其实验诊断的概述 结核病实验诊断的管理要求 结核病实验诊断的技术规范 附录
结核病实验诊断操作规程
第一章 结核病及其实 验诊断的概述
结核病实验诊断操作规程
（二）分枝杆菌培养
结核病实验诊断操作规程
优点：分枝杆菌的分离培养和菌种鉴定能为结核病患者 提供最终的诊断依据，与涂片相比可显著提高阳性检出 率（通常提高30%-50%）。分离培养同时也为药物敏 感性试验提供实验菌株。
缺点：操作更复杂，价格更昂贵，且菌体生长周期缓慢 ，并要求由专门的实验技术人员进行操作，用特殊的实 验仪器进行培养，且所有实验必须保证在恰当的生物安 全条件下才能开展。
结核病实验诊断操作规程
第二节 结核病基础知识
一、结核病定义和传播途径 结核病实验诊断操作规程
结核病是由结核分枝杆菌复合群（ Mycobacterium tuberculosis complex,简称 结核分枝杆菌）引起的慢性感染性疾病，可累及 全身多个器官系统，最常见的患病部位是肺脏。
传播途径主要是通过呼吸道传播。 个体吸入含有结核分枝杆菌的飞沫后是否患病取
临床检测分枝杆菌的最终目的是为 了辅助分枝杆菌感染患者的诊断及 治疗。
根据病人标本类型不同，所分离到 分枝杆菌的临床意义也各不相同， 实验室应尽快对病原菌做出鉴定， 以确定其临床意义。
（一）非结核分枝杆菌
结核病实验诊断操作规程
找到非结核分枝杆菌的临床意义取决于很 多因素，包括： 临床环境和宿主状态 病原菌种类及其致病性 分离培养标本的来源及其被污染的可能性 被检出病原菌的数量（包括抗酸染色涂片） 阳性培养的次数
肺结核：意指肺内结核。粟粒性结核有肺部病灶 者也归类为肺结核。
肺外结核：包括结核性脑膜炎、心包膜结核、腹 膜结核、脊椎结核、脊椎以外的骨与关节结核、 肠结核、生殖泌尿系統结核，淋巴结核、皮肤结 核；胸腔內的肺门或纵膈腔淋巴结核或单纯结核 肋膜积液属肺外结核。
结核病是一种严重危害人民健康的慢性 传染病，目前全球有约20亿人被感染， 每年新出现结核病患者约800-1000万， 每年因结核病死亡人数约为200-300万。 我国结核病患病人数居世界第二位，仅次 于印度。我国结核病年发病人数约为130 万，因结核病死亡人数每年达13万，超 过其他传染病死亡人数的总和。结核病是 我国重点防控的重大传染性疾病之一。
限制因素：样本在培养之前必须去污染，以抑制其他杂 菌的生长。所有去污染的操作对分枝杆菌都有一定程度 的伤害，因此，培养灵敏度不能达到100%。
（三）基因检测及鉴定
结核病实验诊断操作规程
优点：在检测速度、操作标准化、潜在高流通量以及 较低的生物安全要求等明显方面。
2019年，WHO认证了用分子线形探针试验（LPAs） 可以快速检测利福平耐药性（单独耐药或与异烟肼联 合耐药）。
血液，骨髓
龟分枝杆菌，脓肿分枝 慢性免疫抑制药（如类固醇激素）
杆菌或嗜血分枝杆菌 导致的浸润性皮肤损伤
活检/抽吸物
龟分枝杆菌，类龟分枝 中央静脉导管，假肢，
杆菌，偶发分枝杆菌或 创口，脓肿分枝杆菌
注查
结核病实验诊断操作规程
结核分支杆菌检查是确诊结核病 最特异的方法。
（一）痰涂片
结核病实验诊断操作规程
优点：操作简便，价格低廉，能快速检测出感染 性肺结核。
缺点：直接涂片法灵敏度相对不高，要求每毫升 痰标本中至少要包含5,000个杆状细菌才能检出 阳性。肺外结核、HIV合并感染结核以及非结核 分枝杆菌（NTM）感染的涂片灵敏度更低。
限制因素：抗酸杆菌（AFB）涂片镜检不能区分 结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌（NTM），也不 能区分死菌与活菌、耐药与敏感菌株。