蛋白质SDS-PAGE电泳注意事项.doc
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析)
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤1.名称：SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2.原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。
为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。
上样缓冲液由Tris-HCl （pH6.8）、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。
其各自的作用如下述：SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。
同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。
另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
SDS-PAGE电泳标准操作规程（SOP）rosoftOfficeWord文档
SDS-PAGE电泳标准操作规程（SOP）rosoftOfficeWord文档SDS-PAGE电泳标准操作规程(SOP)一．仪器装置1．电泳仪2．夹心式垂直电泳槽3．玻璃板：长14.5×11.5×2mm、短14.0×11.5×2mm4．可调微量移液器5．微量进样器6．转移脱色摇床二．试剂配制1．丙烯酰胺液（30%T/2.7%C）用天平分别称取58.4g丙烯酰胺（Acr）和1.6g N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis），溶于120ml温热（37℃左右，以利于溶解Bis）的去离子水中，然后转移至200ml容量瓶中，补加去离子水至刻度，摇匀，用滤纸过滤后，检查其pH值应不大于7.0，贮存在棕色瓶中，4℃保存。
每隔2个月重新配制。
小心：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套。
如不慎接触皮肤，应立即用水和肥皂清洗。
2．分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH8.8）用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
3．浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH6.8）用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH 值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
4．10% 十二烷基硫酸钠溶液用天平称取20.0g 电泳级十二烷基硫酸钠（SDS），加180ml去离子水，68℃水浴使溶解后，用去离子水定容至200ml，室温保存。
5．10% 过硫酸铵溶液用天平称取0.50g过硫酸铵（APS），溶于5ml去离子水中，分装Eppendof管冰冻保存。
6．四甲基乙二胺（TEMED）液7．分离胶覆盖液（（0.375M Tris-HCl，pH8.8，0.1% SDS）取分离胶缓冲液25ml、10% SDS溶液1.0ml，混匀，加去离子水定容至100ml，室温保存。
在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时,应注意以下几个问题
1．如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。
一般以巯基乙醇作还原剂。
在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。
（2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。
（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。
2．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量25,000—200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.000—70,000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,000—50,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。
可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。
标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率，详见后）最好在0.2—0.8之间均匀分布。
在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。
3．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。
SDS-PAGE电泳注意事项.docx
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白 - SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（ AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为的 Tris-HCl。
分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为Tris-HCl。
电极缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。
2 种孔径的凝胶、 2 种缓冲体系、 3 种 pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径、 pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。
注意问题1.样品处理上样缓冲液的作用：形成 SDS-蛋白复合物，使其带负电；SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。
SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。
2.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用（1）浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
3.提高 SDS-PAGE电泳分辨率的途径待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
SDS-PAGE蛋白质电泳常见问题分析
SDS-PAGE蛋白质电泳常见问题分析日期：2012-05-25 来源：互联网作者：青岚点击：2218次摘要：SDS-PAGE电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸，SDS-PAG 蛋白质电泳分析可从蛋白质亚基分子量的大小就分离蛋白质。
找产品，上生物帮>> >>SDS-PAGE电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸，SDS-PAG 蛋白质电泳分析可从蛋白质亚基分子量的大小就分离蛋白质。
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS-PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS-PAGE电泳的基本原理?A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)，SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响?A：在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
SDS-PAGE电泳注意事项
SDS-PAGE电泳的操作规程一、样品处理取适量体积的样品溶液（样品含约为0.5-5ug），加入5×样品缓冲液，用振荡器混匀，于95℃水浴中煮5分钟，并于离心机中12000r/min离心5分钟待上样用，煮完后室温冷却。
非还原不用煮。
二、配制凝胶溶液和灌胶A、预先计算好所需浓度胶的体积及配胶所需要的各种试剂的体积，按这些数据依次加入试剂并混匀，然后灌入预先装好并且用双蒸水试漏过的板层中（先是分离胶），在胶的上面加一小层水饱和的异丁醇，置于平整的桌面让其自然凝固。
B、待分离胶凝固后（以胶与异丁醇界面有折射为准），到掉上层的异丁醇，用双蒸水冲洗三次并用吸水纸吸干。
然后灌入预定浓度的、按步骤A配制的浓缩胶，插入加样梳（注意赶走气泡），平置于水平桌面，自然凝固。
C、待凝固后，放置1小时使胶充分交联凝固。
三、电泳1、拔掉梳子，用双蒸水冲洗加样孔，去除杂质及未凝固的胶溶液，然后装好电泳装置，加入电泳缓冲液（如阴阳极缓冲液不同，需要分别加入相应的缓冲液，另外，阴阳极电泳缓冲液不要混在一起）2、用20ul的微量加样枪上样。
3、电泳开始时，恒压模式下用80V的电压电泳，待指示剂溴酚蓝进入分离胶时，把电压提高到130-150V左右，直到溴酚蓝快走出分离胶时，终止电泳，切断电源，拆下凝胶分别切下上、下角标记胶的方向及区别是哪一块胶。
4、清洗胶架、玻璃及其他附件。
四、染色、脱色及结果的分析与保存1、把剥下的胶浸入染色液中，放在脱色摇床上摇1小时。
2、取出凝胶块，用蒸馏水冲洗干净，然后置于脱色液中脱色，摇荡脱色直到底色基本脱完。
3、脱完色的胶用凝胶成像系统照相并进行数据分析处理。
一、试剂的使用与管理1、30%的丙烯酰胺贮存液（棕色瓶中保存）、pH8.8的缓冲液、PH6.8的缓冲液、10%的AP、TEMED用完后请放回4℃冰箱。
2、2×上样缓冲液，用完后请存放于-20℃冰箱的指定位置。
3、中分子量marker请按照说明书配制，配制后于95℃水浴中煮5分钟，冷却后离心，分装到eppendorf管中，每管10 U L。
SDS-PAGE全细胞蛋白电泳
2.2.5 SDS全细胞蛋白电泳提取蛋白质：用Ependorf管离心收集菌体（对数生长期），称其重量，并用样品缓冲液（sample buffer）裂解细胞，使其浓度达到150 mg⋅ml-1，放入-20℃冰箱中，临用前在95℃下加热10 min，并以4000 rpm/min离心2 min，待用。
电泳：用DYCZ-24D双垂直电泳槽，10%的分离胶，5%的浓缩胶。
先灌分离胶，等其凝固后再灌入浓缩胶，同时插好梳子。
电泳前将2.1.2.5中样品取出溶化后在95℃下加热10 min放在冰上冷却后即可点样，第一个孔点buffer，第二个孔点marker，其余每孔点样7 μl，电泳时恒流30 mA，视其指示剂溴酚兰到达胶的底端为止。
胶的染脱色及判读：电泳完把胶取下放在大小适合的盒子里，放入染色液在37℃摇床振荡30 min，然后用脱色液脱色，遵循少量多次原则（约5次），直到背景蓝色褪去。
把胶放在紫外成像仪上照相观察，把条带相同的归为一类。
所需试剂：样品缓冲液：4 ml 水；1 ml 0.625 M Tris-HCl，pH 6.8；0.8 ml 甘油；1.6 ml 10% SDS；0.4 ml β-巯基乙醇；0.2 ml 1%百里溴酚兰。
电泳缓冲液：3.03 g Tris base，14.41 g 甘氨酸，1 g SDS；加水到1000 ml；pH 8.4+0.1。
下胶缓冲液：18.17 g Tris Base，2 ml 20%SDS溶液，pH 8.8，加水到100 ml。
上胶缓冲液：6.06 g Tris Base(1.5 M), 2 ml 20%SDS溶液，pH 6.8，加水到100 ml。
10ml 10% 分离胶：2.5 ml 下胶缓冲液；3.4 ml H2O；4.1 ml Acry/biscrylamide (24.2%, 30:1) ; 30 μl 10%的过硫酸铵; 20 μl TEMED。
5 ml5% 浓缩胶：1.25 ml 上胶缓冲液; 2.25 ml 水; 1 ml Acry/biscrylamide(24.2%); 30 μl 10% 的过硫酸铵; 20 μl TEMED。
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匀浆：
1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。
2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。
3.所有操作尽量在冰上进行。
4.94℃水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事
先要打开升温）。
5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。
6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。
7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到
4℃，即可。
8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。
9.SDS,DDT,PMSF是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。
制胶：
10.APS和TEMED是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30％。
11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。
12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。
（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。
）
13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm的玻璃板用白色条带封底。
（封紧以防
漏胶）
14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。
15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。
一般要
5-10分钟。
而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。
16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。
（点在边上时，跑出的带是斜的）
17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。
18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。
19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）
20.脱色时，尽量多次进行换水。
21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl.
22.做胶时，凝胶时间控制在25min。
梳子不能歪来歪去。
23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。
24.制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气
泡。
注意：温度，时间，光照，APS和TEMED都会对凝胶产生影响。