发酵设备及消毒灭菌
第四章-发酵工程的灭菌与空气除菌
7、杀灭细菌芽孢的温度和时间
成熟的细菌芽孢除含有大量的钙-吡啶二羧酸成分外，还处于脱水 状态，成熟芽孢的核心只含有营养细胞水分的10%～30%。这些特性 大大增加了芽孢的抗热和抵抗化学物质的能力。
在相同温度下杀灭不同细菌芽孢所需时间不同，一方面因为不同 细菌芽孢对热的耐受性不同，另外培养条件的不同也使耐热性产生差 别。
在发酵过程中夹杂其它杂菌会造成严重的后果
如，生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连 续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得 更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物 质，使提取精制发生困难；杂菌会降解目的产物；杂菌 会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发 生溶菌现象。
优点：无需专一灭菌设备，操作简便。 缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分的现象，发 酵罐利用率低。 灭菌流程：培养基的加热一般用直接蒸汽通入罐内，冷却是冷却 水通入蛇管或夹层间接进行。灭菌时间过程包括：加热、维持、 冷却所需要的时间。
• 流程操作：先预热一定时 间，使物料溶胀均匀受热， 预热90℃以上时，将蒸汽 直接通入培养基及罐中，
一、定义 1、培养基灭菌的定义
是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及 其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养 基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 2、灭菌与消毒的区别 • 灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或 除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽 孢和孢子 • 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿 内外的病源微生物。
表 多数细菌芽孢的灭菌温度与时间
8、影响培养基灭菌的因素
（1）培养基成分
培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高 浓度盐类、色素能削减其耐热性。
第四章发酵工业的无菌技术
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
2.3发酵罐及灭菌方法
第一节 物理消毒灭菌法
热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 超声波杀菌法 干燥与低温抑菌法
一. 热力灭菌法
干热灭菌法— 焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械 湿热灭菌法（moist heat sterilization)— 巴氏消 毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7℃15-30s,主要用于 牛乳消毒。 煮沸法；流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法； 高压蒸汽灭菌法
消毒剂的种类：酚类、醇类、重金
属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷 化剂。
消毒剂的应用：病人排泄物与分泌
物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空 气、手。
第三节 影响消毒灭菌效果的因素
消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物
发酵罐按容积分类
一般认为500L以下的是实验室发酵罐；
500-5000L是中试发酵罐；
5000L以上是生产规模的发酵罐。
现代发酵工程规模
低值工业品大型化
以规模来取胜 （几十数百吨）。如味精、氨基酸、 有机酸、抗生素、饲料、食品工业用 产品等；
高价值转基因产品小型化（几十数
百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌 高密度培养；动物细胞植物细胞培养；
二. 辐射杀菌法
紫外线 波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。 其主要作用于DNA，使一条DNA链上相 邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体， 导致细菌变异和死亡。 电离辐射 高速电子、X射线、γ射线 微波 波长1mm~1m
三. 滤过除菌法
赛氏滤器
玻璃滤器
薄膜滤器
四. 超声波杀菌法
工业发酵灭菌与消毒
间接蒸汽加热灭菌
优点 保留较多的营养质量 容易放大，较易自动控制 糖受蒸汽的影响较少 缩短灭菌周期 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少 发酵罐利用率高，蒸汽负荷均匀。
缺点 设备比较复杂，投资较大罐灭菌： 实罐灭菌时，与培养基一起灭菌 连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌前进行空消
（2）培养基成分
培养基中的油脂、糖类、蛋白质等有机化合物，会在微生物细胞周围形成一层 薄膜，影响热的传导，增加了灭菌难度。
（3）培养基含菌量
不同成分的培养基其含菌量是不同的，天然基质培养基，特别是营养丰富或变质的原料中 含菌量远比化工原料的含菌量多，因此灭菌时间要适当延长。含芽孢杆菌多的培养基，要适 当提高灭菌温度和延长时间。
优点：能耗低；空气压力损失 小；除尘效率高
缺点：高压技术，设备庞大
三、介质过滤除菌
（一）绝对介质过滤 机制：微生物大于孔径 介质：微孔滤膜、微孔虑棒、折叠微孔膜滤心
(孔径0.2 um)
(二)深层过滤介质
1.深层介质过滤器除菌的机制
重力沉降：可以忽略 惯性冲击：空气流速大时，起主导作用 阻截：空气流速小时，起主导作用 扩散：布朗运动 静电吸附
连续灭菌（连消）：将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却然后进入到灭 菌反应器的灭菌方法就是连续灭菌。
（1）分批灭菌
在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温 三个过程。
实消的步骤：配料→夹套进蒸汽→液面以下进蒸汽入培养基→直接升温→ 液面以上排汽打开 → 恒温→通无菌空气→降温
•分空气过滤器在发酵罐灭菌之前进行灭菌，灭菌后用空气吹干备用。 •管路可与罐同时进行灭菌，但保温时间为1h。上述各种管路在灭菌之前，要进行严格检查，以防泄 漏和“死角”的存在。
发酵灭菌与消毒方法
发酵灭菌与消毒方法的选择作者飞扬发表于2010年8月13日消毒与灭菌方法的选择1. 前言在制药、食品、轻工及医疗卫生等各行业领域，常需要对某些物品或产品、以及使用和生产这些物品或产品所需的原辅料、包装材料、设备、工器具、生产设施与环境进行必要的消毒和灭菌，甚至包括操作人员同样需要采取必要的消毒与灭菌措施，以确保经消毒与灭菌后的物品或产品符合规定的质量标准。
消毒与灭菌是既相似又有区别的二类概念，必须根据处理物品的用途和危险程度区别对待，以确定是采用消毒或灭菌工艺；其次由于消毒与灭菌处理的直接对象是待处理物品上被污染的微生物，随微生物种类、性状和抵抗力的不同，可供选择的消毒与灭菌方法也可有所不同；再者，在用消毒与灭菌方法杀灭或去除各种微生物的同时，也使被微生物污染的物品处于相同的消毒灭菌过程中，而这些物品或产品的使用价值、理化性状及除被微生物污染外的其它影响消毒灭菌效果的情况等又是消毒与灭菌方法选择时需不得不加以综合考虑的重要因素。
因此，为能合理选择消毒与灭菌方法，有必要对消毒与灭菌的基本概念、微生物的基本知识、各种消毒与灭菌方法的基本特点、适用范围及影响消毒灭菌效果的基本因素有个全面的认识与了解；而且一旦选择了消毒灭菌方法，还需对其操作的有效性、可靠性与安全性进行严格的验证。
. 消毒与灭菌的基本概念灭菌是指杀灭或去除外环境中一切微生物的过程，包括病原和非病原微生物及细菌芽孢，使之完全无菌。
消毒是指杀灭或去除外环境中病原微生物的过程，使之无害化，不致引起感染或致病。
从上述定义可知，消毒和灭菌都要求杀灭或去除外环境中的微生物，只是杀灭或去除的目标微生物和程度不同,即消毒处理不一定都能达到灭菌要求，而灭菌一定可达到消毒的目的。
另外需指出的是，对灭菌而言，其达到的无菌状态，一方面虽指不含有任何活体微生物，但并不排除杀灭以后非活体微生物残骇的存在；另一方面，从定义上来说无菌是一个绝对的概念，但作为一项设定的质量标准，它受到必须具备的三个基本条件：现实性、可验性和安全的限制，因而从現实情况而言，无菌是相对的。
发酵工程的灭菌与除菌2讲课文档
因为过滤介质层是由无数的纤维纵横交 错组成的，形成的网格阻碍气流前进，使气 流无数次地改变运动速度和运动方向，这些 改变引起空气中微粒的惯性冲击、拦截、扩 散、重力沉降和静电吸附等作用，于是大大 增加了微粒被纤维捕获的几率。
32
第三十二页，共一百一十九页。
(1)惯性冲击截留作用：撞上去被吸附；
相对热阻：是指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微 生物在相同条件下的致死时间之比。
第十五页，共一百一十九页。
灭菌方式
大肠杆菌
细菌或酵母 营养细胞
细菌芽胞 霉菌孢子
噬菌体 和病毒
干热
1
湿热
1
苯酚
1
甲醛
1
紫外线
1
1
1000
2~10
1
1
3×106
2~10
1~5
1
10×108 1~2
30
1
250
2~10
我国在GMP验证过程中人们大力推荐臭氧灭菌方法。臭氧 灭菌有许多特点：
① O3为气体，能迅速弥漫到整个灭菌空间，灭菌无死角，浓度分
布均匀。
②臭氧灭菌为溶菌级方法，杀菌彻底。杀菌能力与过氧乙酸相
当，高于其它消毒剂。
③杀菌广谱，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等， 并可破坏肉
毒杆菌毒素。另外，O3对霉菌也有极强的杀灭作用。
病毒 霉状分枝杆菌
细胞：宽×长/μm 1.0~1.5×1.0~2.5 1.3~2.0×8.1~25.8 0.5~1.0×1.0~3.0 0.5~0.7×1.8~3.3 0.9~2.1×2.0~10.0 0.6~1.6×1.6~13.6 0.5~1.1×1.6~4.8 0.5~1.0×0.5~1.0 3.0~5.0×5.0~19.0 0.0015~0.225×0.0015~0.28 0.6~1.6×1.6~13.6
发酵实验灭菌方法
发酵实验灭菌方法一、干热灭菌法干热灭菌法是指在干燥环境中进行高温灭菌的方法。
通常是将待灭菌的物品放在烘箱、干燥箱或火焰中加热，以达到灭菌的目的。
此方法的优点是能够杀死绝大多数微生物，而且对不耐湿热的物品尤为适用。
然而，干热灭菌所需温度较高，时间较长，可能会对某些物品造成损坏。
二、湿热灭菌法湿热灭菌法是指利用高温水蒸气进行灭菌的方法。
在发酵实验中，常用的湿热灭菌设备有高压蒸汽灭菌器和常压蒸汽灭菌器。
湿热灭菌法的优点是杀菌效果好，对大多数微生物都能有效杀死，而且对物品的损伤较小。
但是，湿热灭菌法需要一定的时间和能源，而且在使用过程中要注意防止物品受潮。
三、紫外线灭菌法紫外线灭菌法是利用紫外线照射杀灭微生物的方法。
紫外线具有较好的杀菌作用，而且对人体的伤害较小。
在发酵实验中，可以使用紫外线灯对实验室内空气、表面和物品进行消毒。
然而，紫外线灭菌法对于隐藏在角落或缝隙中的微生物效果不佳，而且长时间照射可能会对某些物品造成损坏。
四、过滤除菌法过滤除菌法是指通过过滤介质去除微生物的方法。
在发酵实验中，常用的过滤除菌设备有滤膜过滤器和超滤器。
过滤除菌法的优点是不加热、不损伤物料、操作简便等。
但是，过滤除菌法只能去除液体中的微生物，对于气体和固体颗粒中的微生物效果不佳。
此外，过滤介质需要定期更换或清洗，以保证过滤效果。
五、化学消毒剂灭菌法化学消毒剂灭菌法是指利用化学消毒剂杀灭微生物的方法。
常用的化学消毒剂有酒精、漂白粉、甲醛等。
这些消毒剂具有较好的杀菌作用，而且使用方便。
然而，在使用化学消毒剂时要注意安全，避免对人体造成伤害，同时也需要注意防止消毒剂残留对实验结果造成影响。
六、辐射灭菌法辐射灭菌法是指利用放射性物质发射的射线杀灭微生物的方法。
常用的辐射源有钴-60和铯-137等放射性同位素。
辐射灭菌法的优点是杀菌效果好、时间短、操作简便等。
但是，辐射灭菌法的设备投资较大、成本较高，而且放射性物质有一定的危险性，需要专业人员操作和维护。
发酵过程中控制杂菌的方法
发酵过程中控制杂菌的方法
1.设备与环境消毒：
-在发酵前，应对所有接触发酵物料的设备，如发酵罐、管道、过滤器、阀门等进行全面、彻底的清洁和消毒，可使用高温蒸汽灭菌、化学消毒剂浸泡等方式进行消毒处理。
2.培养基灭菌：
-制备的发酵培养基必须在严格的无菌条件下操作，通过高压蒸汽灭菌或其它适用方式彻底灭菌，确保无任何杂菌存在。
3.无菌操作技术：
-接种、转接、取样等操作应在无菌操作台上进行，操作人员需要穿戴无菌防护装备，遵循无菌操作规程，避免引入杂菌。
4.种子纯化：
-使用纯净、活性良好的种子进行接种，必要时对种子进行多次传代净化，剔除可能携带的杂菌。
5.温度与pH控制：
-发酵过程中适当调整和控制温度、pH值等参数，创造有利于目标菌株生长而不利于杂菌滋生的条件。
6.监控与检测：
-定期对发酵过程进行监测，包括pH值、溶解氧、浊度等指标的变化，及时发现异常。
并对发酵液进行微生物检测，一旦发现杂菌污染，立即采取相应措施。
7.添加抑菌剂：
-在某些情况下，可在发酵过程中添加适量的抑菌剂或抗生素来抑制杂菌生长，但这需要考虑对目标菌株的影响。
8.应急措施：
-若发现早期染菌，可通过降低培养温度、调整补料策略、补充杀菌剂或抗生素等手段尝试挽救；若中后期染菌且不影响产品质量，则可考虑提前终止发酵。
9.优化工艺流程：
-改进工艺流程，如采用一次性使用系统、密闭连续流发酵技术等，减少人为操作带来的污染风险。
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菌体浓度 • 在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓
度成正比关系。特别是初级代谢产物。 • 菌体浓度过低，产物产率下降。 • 菌体浓度过高，产生其他影响。 • 措施：调节培养基中的营养物质的浓度。
营养物质 • 碳源 • 氮源 • 磷酸盐：生长亚适量浓度 • 补料：半饥饿状态
温度 • 考虑菌种及生长阶段 • 综合考虑其他培养条件 • 考虑菌种生长情况
L/O/G/O
代谢调控
• 运用人为的方法对微生物的代谢调节系统进行遗 传改造和条件的控制，在保证微生物适当生长的 条件下，建立新的代谢方式，以期按照人们的意 志有目的地过量积累所需的代谢产物，提高生产 效率。
初级代谢
• 能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具 有生理活性作用的物质，或是为机体生长提供能 量的一类代谢。
抗生素的发酵生产
L/O/G/O
抗生素的定义
• 生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓 度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细 胞的有机物。
发展历史
• 1929年，英国弗莱明发现青霉素。二战期间，大 规模发酵生产，世界上最早用于临床的抗生素 。
• 20世纪60-70年代，利用生物合成和半合成方法 研制抗生素衍生物。
第三节 发酵设备及消毒灭菌
L/O/G/O
发酵的一般流程
培养基配制
种子扩大培养
空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
发酵设备——发酵罐
发酵罐的特点 ➢ 轴封严密，泄漏少 ➢ 能承受一定压力、温度 ➢ 搅拌通风装置保证气液充分混合 ➢ 具有足够的冷却面积 ➢ 死角少，灭菌彻底 ➢ 适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）
分解代谢
生物合成
生长
抗生素、生物碱、色素、 毒素等次级代谢产物
代谢产物合成的调控
• 初级代谢对次级代谢的调节 • 碳代谢物的调节 • 氮代谢物的调节 • 磷酸盐的调节 • ATP的调节 • 诱导物调节 • 末端产物的反馈调节 • 细胞膜通透性调节 • 其他：金属离子、溶解氧等的调节
初级代谢对次级代谢的调节
发酵罐的类型 • 搅拌釜反应器 • 鼓泡式反应器 • 气升式反应器
发酵辅助设备
无菌空气系统 • 无菌空气的要求 灭菌系统、管道、阀门
培养基及其灭菌
培养基（medium） 培养基的成分 • 碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂
培养基的类型 • 按组成 • 按状态 • 按用途
培养基灭菌 • 空罐灭菌 • 实罐灭菌 • 连续灭菌：高温短时
• 20世纪80年代至今，根据作用机理理性筛选阶段， 包括耐药筛选模型等。
抗生素的分类
• 根据抗生素的生物来源分 • 根据抗生素的作用对象分 • 根据抗生素的作用机制分 • 根据抗生素的化学结构分
根据抗生素的生物来源分
• 放线菌产生的抗生素：链霉素、四环素、红霉素 • 真菌产生的抗生素：青霉素、头孢菌素 • 细菌菌产生的抗生素：多粘菌素、杆菌肽
• 次级代谢产物以初级代谢产物为母体衍生而来。 • 次级代谢产物合成反应的酶由初级代谢途径的酶
演化而来。 • 因此，初级代谢终产物的过量往往会抑制次级代
谢产物的合成。
碳代谢物的调节
葡萄糖效应 解除方法 • 变更速效碳源和迟效碳源的配比； • 流加葡萄糖。
氮代谢物ห้องสมุดไป่ตู้调节
分解代谢物阻遏效应 解除方法 • 变更速效氮源和迟效氮源的配比； • 流加无机氮。
磷酸盐的调节
磷酸盐效应：类似于葡萄糖效应 机制： • 促进初级代谢、抑制次级代谢 • 抑制次级代谢产物前体的形成 • 阻遏某些关键酶的合成 • 抑制某些关键酶的活性 • 增加菌体能荷状态
ATP的调节
• 直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的 活性。
• 如四环素的合成。
诱导物调节
• 某些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶。 • 需有诱导物存在，诱导酶才能形成。 • 如甲硫氨酸诱导头孢菌素C。
根据抗生素的化学结构分
• β-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类 • 氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素 • 大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素 • 四环类：四环素、土霉素 • 多肽类：多粘菌素
第四节 发酵工程制药的 过程与控制
L/O/G/O
种子的扩大培养
微生物发酵方式
• 分批发酵 • 补料分批发酵 • 半连续发酵 • 连续发酵
发酵过程中的中间分析项目
➢ 产物产量 ➢ pH ➢糖 ➢ 氨基氮 ➢ 菌丝形态
发酵过程的影响因素及控制
➢ 菌体浓度 ➢ 营养物质 ➢ 温度 ➢ pH ➢ 溶氧 ➢ 泡沫 ➢ 染菌 ➢ 发酵终点的判断
根据抗生素的作用对象分
• 抗G+的抗生素：青霉素、红霉素 • 抗G-的抗生素：链霉素、多粘菌素 • 广谱抗生素：氨苄青霉素 • 抗真菌抗生素：两性霉素 • 抗病毒和噬菌体抗生素：氯霉素、艾霉素 • 抗原虫抗生素：灭滴虫素 • 抗癌抗生素：阿霉素、博莱霉素
根据抗生素的作用机制分
• 抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素 • 抑制细胞膜功能：多粘菌素 • 干扰蛋白质合成：四环素 • 抑制核酸合成 ：博莱霉素、利福霉素 • 抑制生物能作用：抗霉素
• 发酵热
pH • 补加酸或碱和补料的方式
溶氧和CO2 • 溶氧异常下降 • 溶氧异常上升 ➢ 措施
泡沫 • 负面影响 • 措施
染菌 • 发酵前期染菌 • 发酵后期染菌
发酵终点的判断 • 提高产物的产量和经济效益 • 降低生产成本
➢ 主要指标与中间分析项目雷同
第五节 发酵工业中的 代谢调控
末端产物的反馈调节
• 末端产物抑制合成途径中的第一个酶的活性，从而 降低产物合成代谢的能力。
• 原位产物分离偶联技术（in situ product removal， ISPR）
细胞膜通透性调节
• 利于代谢产物分泌到胞外，减少胞内浓度，从而 避免末端产物的反馈调节。
• 如：谷氨酸的生产，采取控制生物素浓度、添加 青霉素、添加吐温80等表面活性剂、选育油酸缺 陷型菌株等方法。
次级代谢
• 存在于某些生物中（如某些植物和微生物），并 在一定的生长期内出现的一类代谢。在抵御恶劣 环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物时很重 要。
微生物初级代谢与次级代谢的关系
多糖、蛋白质、 脂肪、无机盐
分解 合成
初级代谢中间产 物（单糖、氨基 酸、核苷酸、脂
肪酸）
蛋白质、核酸、 粘多糖、脂多糖 等生物大分子