LAMP环介导等温扩增法技术临床应用PPT课件
合集下载
LAMP技术 PPT
类型的文件，普通文本格式（仅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。 • 第二，从下面三个选项中选择定参数设定（引物设计条件）条件。基于GC含量的自
动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如 果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 • 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构 的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计 LAMP反应的引物。
LAMP技术
10
• 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷 酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核 苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处 终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调 整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终 止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处 理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合 酶，双链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、 dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引 物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP），因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸 二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况 下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和 以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信 息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条 件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将 制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中 的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱 即可直接读得DNA的碱基序列。与DNA复制不同的是sanger测序中的引物是单引物或 者是单链
动判断, 起始的参数是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，则选取AT丰度高的区,如 果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区,其它情况是标准设定状态。 • 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构 的形成，Tm值等因素可以通过Pimer Explore)(一种专门设计LAMP引物的软件)来设计 LAMP反应的引物。
LAMP技术
10
• 利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷 酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核 苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处 终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调 整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终 止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处 理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合 酶，双链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、 dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引 物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP），因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸 二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况 下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和 以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分 离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信 息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条 件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将 制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中 的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱 即可直接读得DNA的碱基序列。与DNA复制不同的是sanger测序中的引物是单引物或 者是单链
第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
环介导等温扩增技术
总之,LAMP方法是一种特异性强、灵敏度高、方 便快捷的检测方法,为金黄色葡萄球菌的检测提供了新 的方法,具有很高的使用价值。
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
环介导等温扩增技术原理ppt课件
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要 求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
3
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
4
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
形 成
基 础 结 构
14
LAMP
15
16
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
8
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
9
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
3
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
4
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
形 成
基 础 结 构
14
LAMP
15
16
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
8
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
9
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。
目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
环介导等温扩增
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。
LAMP的特点：（1）特异性强。
LAMP能从仅相差1个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增。
（2）等温高效。
LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，而且受非靶序列的影响小。
与PCR相比，其检测极限更小，仅为几个拷贝。
（3）耗时短。
在1h内可把靶序列扩增至109倍。
（4）产物易检测。
（5）操作简便。
反应不需PCR仪和特殊试剂。
通过逆转录酶，LAMP即能进行RNA高效扩增。
LAMP因具有高特异性、高效率和快速反应的特点，可以大量扩增所需的靶序列，故被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。
LAMP和其他的核酸扩增技术相比，可以在等温条件下，快速、高效、高特异地扩增靶序列。
但是，其引物设计比传统的PCR复杂，而且因为其产物的独特性，为单链DNA的分离增加了难度。
所以，还需要研究出更加有效的分离方法，同时摸索LAMP反应的条件，从引物的长度与浓度、目的序列的大小、茎环结构的大小等方面进行优化，提高扩增效率和特异性。
环介导等温扩增技术
延伸循环步骤
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别
形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’)
作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序
列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些
具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的
折叠结构的DNA 的混合物。
精品PPT
LAMP法实验室常规操作步骤
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
精品PPT
精品PPT
精品PPT
精品PPT
优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
• 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
精品PPT
精品PPT
精品PPT
应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
LAMP环介导等温扩 增法技术临床应用
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
02
优势：快速、简便、 灵敏度高
03
应用范围：呼吸道感 染、消化道感染、血 液感染等病原体检测
基因突变检测
1
原理：利用LAMP环介导等 温扩增法技术，对基因突变
进行检测
2
应用范围：肿瘤、遗传病、 传染病等疾病的基因突变检
测
3
优势：操作简便，快速高效， 成本低廉，结果准确
4
局限性：对基因突变类型有 一定限制，需要针对不同基
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
01
原理：利用LAMP环 介导等温扩增法技术，
目录
LAMP LAMP LAMP
壹
术 原 理
环 介 导 等 温 扩 增 法 技
贰
术 临 床 应环 用介
导 等 温 扩 增 法 技
叁
术 发 展 前环 景介
导 等 温 扩 增 法 技
1
LAMP环介导等温 扩增法技术原理
工作原理
利用环介导等温扩 增技术，在恒温条 件下进行核酸扩增
技术改进方向
提高反应灵敏度 提高扩增产物的特异性 提高自动化程度
降低反应时间 降低成本和操作难度 拓展应用领域
应用领域拓展
病原体检测：快速、 准确检测病原体，
提高诊断效率
环境监测：应用于 环境监测，提高环 境监测效率和准确
性
基因编辑：应用于 基因编辑技术，提 高基因编辑效率和
安全性
食品安全检测：应 用于食品安全检测， 提高食品安全检测
02
优势：快速、简便、 灵敏度高
03
应用范围：呼吸道感 染、消化道感染、血 液感染等病原体检测
基因突变检测
1
原理：利用LAMP环介导等 温扩增法技术，对基因突变
进行检测
2
应用范围：肿瘤、遗传病、 传染病等疾病的基因突变检
测
3
优势：操作简便，快速高效， 成本低廉，结果准确
4
局限性：对基因突变类型有 一定限制，需要针对不同基
特异性强：针对特定基因序列 设计引物，避免非特异性扩增
结果直观：扩增产物可直接通 过凝胶电泳或荧光定量PCR检 测
2
LAMP环介导等温 扩增法技术临床应 用
病原体检测
01
原理：利用LAMP环 介导等温扩增法技术，
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
“十三五”规划要求逐步推广的新诊断技术
县区级
检测结核分枝杆菌
环介导等温扩增 多色巢氏荧光PCR法
交叉引物发 RNA等温扩增法等
地市级
省、自治区
结核分枝杆菌及是否对 利福平和异烟肼耐药 基因芯片 溶解曲线 线性探针
检测结核分枝杆菌 检测是否对利福平和异
烟肼耐药
LAMP技术的原理
对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用具有链 置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合
➢ 肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
➢ 通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所
以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenI等进行 染色，来检测扩增是否发生。（图C）
2020年5月18日星期一
LAMP法常规操作步骤
2020年5月18日星期一
LAMP法的检测方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
2020年5月18日星期一
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
➢ gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
➢ 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
恒温扩增反应,没有PCR反应中温度变化的耗时,省 却温度循环，在30min～60min内即可完成反应 过程。
只需一个简单的恒温器,不需要昂贵的PCR仪。
产物检测便捷
在合成DNA的同时产生的大量焦磷酸根离子,与 镁
离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，从而能定性 判断LAMP反应；可与荧光物质结合。
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果
➢ 阳性一致率=88.56% ➢ 阴性一致率=93.06% ➢ 总符合率=91.36%
2020年5月18日星期一
WHO 认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测。在 已有肺结核症状的检测者中进行对比，TB-LAMP法比 痰涂片检测法多检出15%的患者。对比WHO近年推荐 的其它快速检测法，如果把TB-LAMP法用于对痰涂片 检测阴性患者的复查，TB-LAMP法检出率要高40%。
➢ 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用 技术特点：
➢ 适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
➢ 反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
2020年5月18日星期一
LAMP法和其他PCR法的比较
2020年5月18日星期一
LAMP法所需的试剂
2020年5月18日星期一
LAMP技术简介
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外 等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约 65℃）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的 热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连 续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相 比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较
2020年5月18日星期一痰标本目测法检测流程100分钟
一、样品处理
1、用2~3倍体积的4%NaOH溶液消化痰液 2、吸取1mL痰液液化液加入无菌1.5mL离心管中
一、样品处理 2、13000r/min离心10min，尽量吸弃上清
➢ 结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
2020年5月18日星期一
LAMP法在结核菌检测中的应用
临床试验
—— LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果
➢ 灵敏度＝89.54% ➢ 特异性＝98.93% ➢ 总符合率＝95.31%
阳性结果预期值＝98.13% 阴性结果预期值＝93.77%
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理
2020年5月18日星期一
LAMP技术特点
灵敏度高 特异性强 速度快
设备简单
LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数，扩 增模板可低至每测试10拷贝或更少。
通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合 来产生扩增效应,因此能获得比PCR更高的特异性。
已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫) LAMP技术因其特异、敏感、简便、快捷、检测方式对
实验室基础设施、设备的要求较少，逐步用于结核分 枝杆菌诊断鉴别中
世界卫生组织于2016年8月11日，在日内瓦发布了一份 最新的推荐书，推荐发展中国家的基础医疗单位使用 该方法，可以作为痰涂片检测方法的替代方案
此PPT下载后可自行编辑修改
LAMP环介导等温扩增法技术临床应用
医者人之司命，如大将提兵，必谋定而后战。
开始啦！请将手机调成静音，如有疑问可以随时打断我！
LAMP技术
环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification , LAMP ) ,是一种在恒定温度下实现核酸 的指数级扩增的技术
成，从而使靶基因高效、快速、特异地扩增。
LAMP法使用的酶
链置换型DNA聚合酶: Bst DNA Polymerase
➢ 扩增对象为双链DNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。 ➢ LAMP法使用最适温度65℃的聚合酶。
2020年5月18日星期一
LAMP法的引物设计
2020年5月18日星期一
LAMP法的原理