电泳技术基本原理和步骤
电泳技术
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电泳技术 第一节 概述 一、基本原理 二、凝胶支持介质 三、检测方法 四、电泳仪器 第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、基本原理 二、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 三、影响分离效果的因素 四、蛋白质分子量的测定 五、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法 六、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围
Hale Waihona Puke 二.凝胶支持介质• 聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是蛋白质电泳中两种杰 出的介质。在通常使用的浓度下，聚丙烯酰胺凝 胶的孔径大小与蛋白质分子属于同一数量级，因 此被认为是分子筛凝胶，而琼脂糖凝胶的孔径较 大，被认为是非分子筛凝胶。 • 三、检测方法 • 在大多数情况下，当电泳结束后，被分离的蛋白 质区带仍然保持在胶内，这时可以通过染色而显 示出分离图谱，从而检测样品的分离情况。常用 的全蛋白质染色方法是考马斯亮蓝法和银染法。
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于是有ｍ＝Ｑ／６πｒη 即迁移率与球形分子的半径，介质黏度，颗粒 所带电荷有关。 • 带电颗粒在电场中的迁移速度与本身所带的静 电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般来说， 所带静电荷越多，颗粒越小，越接近球形，则在 电场中迁移速度越大，反之越慢。
3.电渗 • 电渗就是流动相相对于固体支持介质的移动。 由于电泳支持介质上含有带电基团，主要是酸性 基团，如聚丙烯酰胺会在一定程度上脱氨化，琼 脂糖含有一定比例的硫酸基和羧基，这些固定的 带负电的基团会从缓冲液吸引带正电的反离子， 以保持系统的电中性。这些小的，高度水化的反 粒子是不完全固定的，它会偶然解离进溶液中， 随着电压梯度被带向阴极，直至被凝胶介质上的 下一带电基团所捕获。整体效果就是将液体从阳 极转运到阴极。
• 缩胶浓缩，再经分离胶分离，其中分离胶可以是 均一胶，也可以是梯度胶。均一胶中整块凝胶为 同一浓度，而梯度胶是由连续改变的浓度梯度组 成的，沿蛋白质迁移方向，浓度梯度逐渐增大， 凝胶孔径变小。
电泳生产的过程及原理
电泳生产的过程及原理电泳是一种将带电粒子分离的技术，广泛应用于生物医药、环境保护、食品工业等领域。
电泳分离的原理是利用电场作用下不同带电粒子的迁移速度差异，使它们在电场中以不同速率运动并分离。
电泳的原理可以分为自由移动和强制移动两种模式。
自由移动模式是指带电粒子在电场中受到电荷作用力和摩擦力的影响，从而以自由方式在电极间移动。
强制移动模式是指通过外加电场将带电粒子强制移动。
电泳生产的过程一般包括以下几个步骤：样品处理、准备电解液、装配电泳槽、样品加荷、电泳分离、染色与检测。
首先是样品处理。
样品往往需要经过预处理才能进行电泳分离。
例如，对于蛋白质样品，常规处理包括添加分离缓冲剂、变性、脱氧核酸酶处理等。
接下来是准备电解液。
电解液是电泳分离过程中必不可少的一部分，它提供了电场和离子的介质。
通常电解液是由缓冲剂、离子溶质和必要的添加剂组成的。
缓冲剂的作用是维持溶液的酸碱平衡，使其pH保持在一定范围。
离子溶质的作用则是提供迁移所需的电荷。
然后是装配电泳槽。
电泳槽通常由两块平行电极组成，两个电极之间的空间就是电泳槽。
电极可以是金属板，也可以是特殊的电解质电极。
电泳槽的尺寸和形状可以根据样品的大小和电泳的要求进行设计。
为了防止电泳过程中的热量产生，电泳槽通常会加冷却装置。
接下来是样品加荷。
样品通常通过孔隙电泳技术或浸润电泳技术加到电泳槽中。
孔隙电泳是将样品溶液加在凝胶电泳模板的小孔中，使样品分散到小孔内。
浸润电泳是将电泳槽中的电解液浸润到样品中，然后再将样品转移到电泳槽中。
然后是电泳分离。
加上电场后，带电粒子会受到电荷作用力和摩擦力的影响，从而沿电场方向运动。
根据粒子的大小、形状、电荷和溶液中的介电常数等因素，不同的粒子会以不同的速度运动。
运动的速度取决于所受到的电场力和摩擦力的平衡。
因此，在电泳过程中，带电粒子会根据其电荷、尺寸等特性在电场中分离。
最后是染色和检测。
为了观察分离效果，可以通过染色等方法将带电粒子标记出来。
电泳技术工作原理
电泳技术工作原理
电泳技术是一种在外加电场作用下，利用不同物质的电荷性质差异而实现物质分离的方法。
其工作原理可以简单概括如下：
1. 电荷性质差异：不同物质在溶液中具有不同的电荷性质。
根据溶液中溶质的电荷性质，可以分为带正电荷的阳离子和带负电荷的阴离子。
带电荷的物质可在电场中受到电场力的作用而运动。
2. 电场驱动：在电泳实验中，通过在电解槽中建立一个外加电场，将正负极电极分别连接到电源的正负极，形成一个电场。
这个电场会对带电荷的物质施加电场力，使其在溶液中移动。
3. 分离过程：在电泳实验中，将待分离物质（通常为带电荷的离子或分子）加入到含有电解质盐的缓冲液中，形成电泳液。
电泳液中的离子通过电场力的作用，在电泳槽中逐渐移动并分离出来。
4. 分离效果：由于不同物质在电场力的作用下移动速度不同，电泳液中的不同物质会在一定时间内到达不同位置。
根据不同物质到达的位置，可以通过对电泳槽进行适当的采集和分析，达到物质分离和提纯的目的。
总体而言，电泳技术利用外加电场对带电荷的物质施加电场力，使其在溶液中移动并分离出来，从而实现不同物质的分离、测定和分析。
PAGE电泳原理与步骤
PAGE电泳原理与步骤电泳是一种将带电粒子在电场中移动的技术。
它广泛应用于生物化学、生物分析、药学和分子生物学等领域。
电泳的原理和步骤如下：一、电泳原理：1.带电粒子在电场中移动：带电粒子在电场中受到电场力的作用，从而产生移动，移动的方向和速度取决于粒子的电荷、尺寸和电场强度。
2.电泳液：电泳液是电泳中的介质，一般是由缓冲剂和溶质组成。
缓冲剂主要用于维持pH值，避免电解质的游离和脱水，同时确保带电粒子的稳定性。
3.分离原理：电泳主要通过带电粒子在电场中的迁移速度的差异来实现分离。
根据带电粒子的质量、大小、形状、电荷以及所受到的摩擦力等因素不同，迁移速度也会有所差异，从而实现粒子的分离。
二、电泳步骤：电泳实验通常包括以下步骤：1.制备电泳装置：首先需要制备一个电泳装置。
常用的电泳装置有板式电泳和管式电泳。
板式电泳是将样品放置在平板上进行分离，而管式电泳是将样品注入毛细管中进行分离。
装置的选择根据具体实验需要来确定。
2.制备样品：将待分离物质溶解在适当的溶剂中，使其成为电泳液的一部分。
同时，可以加入一些染料或标记物，以便观察分离结果。
3.加载样品：将样品按照要求加载到电泳装置上。
对于板式电泳，将样品通过特定偏移滤纸或溶胶将其加载到凝胶槽中。
对于管式电泳，将样品通过毛细管导入毛细管电泳装置。
4.施加电场：将电泳装置连接到电源上，在适当条件下施加电场。
电场的选择根据待分离物质的特性和所需的分离效果来确定。
5.电泳分离：在施加电场后，待分离物质开始移动。
移动过程中，不同成分依据其电荷、尺寸和形状的差异，以不同的速度迁移。
6.停止电泳：根据实验要求，适时停止电泳过程。
停止电泳后，可以通过染色、标记或其他检测方法，对分离结果进行观察和分析。
7.结果分析：根据不同实验目的，使用相关方法对分离结果进行分析。
可使用紫外可见光谱、荧光等技术进行定量或定性分析。
同时，可以根据分离结果进行下一步骤的实验设计和分析。
电泳是一种重要的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
电泳技术基本原理和步骤
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)
图 6-16 Laurell 技术示意图及火箭免疫电泳图谱 Ag：抗原；1、2、3为待测标本；4、5、6为标准
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)－－检验医学中的应用
– 火箭电泳放射自显影定量甲胎蛋白
图 6-17 火箭电泳放射自显影定量检测AFP图谱
蛋白质分子为两性电解质 等电点 pH>等电点 带负电 pH<等电点 带正电
基本原理
质点所带净电荷量越多（介质的pH值离等电点越远） 质点的直径越小 越接近球形 则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。
区带电泳
• 检验医学中的应用－－血清蛋白电泳
Alb：清蛋白 α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶 α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白 β：运铁蛋白、补体系统、β脂蛋白 γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE
电泳技术基本原理和步骤
目录
• 第一节 • 第二节 • 第三节 • 第四节 • 第五节 • 第六节 • 第七节 • 第八节
区带电泳 等电聚焦电泳 SDS-PAGE电泳 二维电泳 印迹技术 免疫电泳 高效毛细管电泳技术 电泳分析仪
基本原理
不同性质的质点，由于带电性质及电量不同，在 一定电场强度下移动的方向和速度亦不同。
第四节 二维电泳
• 检验医学中的应用
一个问题：如何确定某个条带 是什么蛋白质？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
第五节 印迹技术
• 免疫印迹法－－基本原理
图 6-13 免疫印迹法的原理
第五节 印迹技术
电泳法分离混合蛋白质的基本原理
电泳法是一种常用的蛋白质分离技术，通过电场作用下蛋白质的迁移速度差异来实现分离。
下面将从基本原理、仪器装置、实验步骤和应用领域等方面介绍电泳法分离混合蛋白质。
一、基本原理电泳法是利用蛋白质在电场中的迁移速度差异来进行分离的技术，其基本原理是蛋白质在电场中受到电荷的影响，带有正电荷的蛋白质在电场中向阴极方向迁移，带有负电荷的蛋白质则向阳极方向迁移。
由于不同蛋白质的分子结构和电荷性质不同，因此其迁移速度不同，进而实现了蛋白质的分离。
在电泳法中，通常会在蛋白质样品中加入一定量的离子从而赋予蛋白质电荷，常用的离子有SDS（十二烷基硫酸钠）和荧光素磺酰氯等。
SDS具有较强的负电荷，在电场中施加电压时，可以使蛋白质呈现负电荷状态，从而呈现出一定的迁移速度。
二、仪器装置进行电泳分离实验需要用到电泳槽、电源、凝胶板和蛋白质样品等仪器和试剂。
电泳槽通常由两个平行的电极板组成，之间用于装载凝胶板。
凝胶板通常有两种，一种是聚丙烯酰胺凝胶，另一种是琼脂糖凝胶。
蛋白质样品经过凝胶板的分离后，需要用染色剂着色才能观察到分离的结果。
凝胶板上的蛋白质迁移痕迹会依据电泳的时间和电压来进行分析。
在进行电泳分离实验时，需要将蛋白质样品加载到凝胶板上，然后施加一定的电压，使蛋白质发生迁移。
根据不同蛋白质的分子大小和电荷性质，它们将会在凝胶板上形成不同的迁移痕迹。
三、实验步骤进行电泳法分离混合蛋白质的实验通常包括以下几个步骤：1. 凝胶制备：根据实验需要选择合适的凝胶材料，制备电泳用的凝胶板。
2. 样品制备：将待分离的蛋白质样品进行处理，通常是在样品中加入一定量的电泳缓冲液和染色剂。
3. 加载样品：将处理后的蛋白质样品加载到凝胶板上。
4. 施加电压：将装载有蛋白质样品的凝胶板放入电泳槽中，然后施加一定的电压，使蛋白质发生迁移。
5. 染色观察：电泳结束后，取出凝胶板并进行染色，观察分离的结果。
四、应用领域电泳法广泛应用于生物学、医学和生物化学等领域，用于分离和分析蛋白质样品中的各种蛋白质成分。
电泳技术的原理和过程
电泳技术的原理和过程电泳技术是一种将带电的微粒或者溶解物通过电场力作用进行分离的方法。
它利用了带电粒子在电场中移动的性质，根据粒子的电荷量、大小和形状的不同，使其分离。
电泳技术的原理基于两个基本原理：电场力和迁移率。
1. 电场力：当带电粒子置于电场中时，电场力作用在粒子上。
这个电场力的大小与带电粒子的电荷量成正比，与电场强度成正比，反向与带电粒子的电荷极性一致。
电场力越大，粒子运动速度越快。
2. 迁移率：带电粒子在电场中的速度也受到其自身性质的影响，即带电粒子在电场中的迁移速率。
迁移率与带电粒子的电荷量、形状和大小有关。
一般来说，带电粒子的迁移率越大，移动速度越快。
基于以上原理，电泳技术的过程包括以下几个步骤：1. 准备样品：将希望分离的样品溶解在电泳缓冲液中，通常是一种带有电解质的缓冲液。
2. 准备电泳设备：将准备好的样品放置在电泳槽中。
槽中的电极接通电源，形成一个电场。
通常，阳极放在电泳槽的末端，而阴极则放在靠近样品的一端。
3. 操作电泳条件：设置适当的电场强度和时间，以保证带电粒子能够在合适的时间内得到分离。
强度太弱会导致分离时间过长，强度太大则可能会破坏分离过程。
4. 进行电泳：开启电源，使电场开始作用。
带电粒子在电场作用下迁移到相应的位置。
正电荷物质向阴极方向迁移，负电荷物质则向阳极方向迁移。
5. 结果分析：根据分离的结果，可以通过各种检测方法来确定目标物质的位置和含量，例如使用染色剂或者检测器。
总的来说，电泳技术通过利用电场力和迁移率的原理，将带电粒子分离开来，实现了分析和纯化的目的。
这种技术在生命科学、生物医学、环境分析等领域有着广泛的应用。
电泳实验技术的使用方法与技巧
电泳实验技术的使用方法与技巧电泳实验是生物学、生物化学和分子生物学研究中常用的实验技术之一，广泛应用于DNA测序、蛋白质分离等领域。
本文将介绍电泳实验的使用方法与技巧，帮助读者更好地应用这一重要的实验技术。
一、基本原理与实验步骤电泳实验通过电场作用，将带电粒子（如DNA片段、蛋白质）在凝胶或缓冲液中进行分离。
首先，我们需要准备电泳仪和凝胶。
1. 凝胶的选择根据待分离物质的大小和性质选择凝胶的种类。
琼脂糖凝胶适用于DNA分离，聚丙烯酰胺凝胶适用于蛋白质分离。
2. 凝胶制备将凝胶原液混合均匀，加入适量硼酸缓冲液，加热至融化。
倒入凝胶板中，在上方贴上胶片，使凝胶均匀平整。
凝胶凝固后，取出胶片。
3. DNA样本制备提取DNA样本后，用酶切或PCR扩增的方法得到待检测的DNA片段。
4. 实验操作将凝胶放入电泳仪中，加入适量的缓冲液，将DNA样本注入凝胶孔中。
接通电源，根据样品大小和凝胶面积调节电压和电流。
等待一段时间后，关闭电源，取出凝胶进行显色。
二、实验技巧与注意事项1. 缓冲液的选择不同的缓冲液适用于不同的电泳实验。
TAE缓冲液适用于DNA电泳，TBE缓冲液适用于RNA电泳。
确保缓冲液质量纯净，不含杂质，可以使用试剂盒购买。
2. 凝胶孔的制作凝胶孔的大小和形状直接影响实验结果。
凝胶孔应该均匀分布在凝胶中，大小适当，孔间距要一致。
3. 样本的负载量负载量过多会导致凝胶中的带呈现模糊不清，负载量过少则带可能不明显，因此需要根据样本浓度和实验需要平衡负载量。
4. 电泳条件的优化试验过程中，适当调节电压、电流和电泳时间，可以提高分离效果。
但过高的电压和电流会导致凝胶破裂，过长的电泳时间会使DNA片段分离不清。
5. 显色与可视化电泳结束后，凝胶中的DNA或蛋白质并不可见，需要通过染色或荧光染料进行显示。
荧光染料比传统的染料方法更加快速、敏感。
6. 实验操作的无菌与安全电泳实验涉及操作试剂和仪器，对于DNA样本的保护应该尽可能避免污染。
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目录
• 第一节 • 第二节 • 第三节 • 第四节 • 第五节 • 第六节 • 第七节 • 第八节
区带电泳 等电聚焦电泳 SDS-PAGE电泳 二维电泳 印迹技术 免疫电泳 高效毛细管电泳技术 电泳分析仪
基本原理
不同性质的质点，由于带电性质及电量不同，在 一定电场强度下移动的方向和速度亦不同。
第二节 等电聚焦电泳
• 区带电泳的原理是不同的蛋白质有不同的电泳速度
• 那么可不可以有另外一种方法：使得不同蛋白质在 泳道中本来就有“固定”位置，蛋白质在相应的位 置上停留？
• 蛋白质如何能够停止电泳？
• 除了切断电源之外？
• 蛋白质不带电了——蛋白质处于等电点溶液中
第二节 等电聚焦电泳
• 基本原理 在等电聚焦电泳时必须有一个稳定的pH梯度介
第四节 二维电泳
• 检验医学中的应用
一个问题：如何确定某个条带 是什么蛋白质？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
第五节 印迹技术
• 免疫印迹法－－基本原理
图 6-13 免疫印迹法的原理
第五节 印迹技术
区带电泳
• 检验医学中的应用－－ 同工酶电泳
图6-3 LDH同工酶区带电泳图谱 左：5份血清iso-LDH电泳图；右：iso-LDH电泳示意图
第一节 区带电泳
• 检验医学中的应用－－ 同工酶电泳
图6-4 CK同工酶示意图 左：血清iso-CK电泳图，3示正 常血清（CK MB<5%），1、2、 4示急性心梗（CK MB>5%）；4 示CK BB阳性； 右：iso-CK电泳图谱示意图
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
第二节 等电聚焦电泳
• 检验医学中的应用－－次级同工酶的分离
图 6-5 碱性磷酸酶同工酶等电聚焦电泳图谱 左：iso-ALP等电聚焦示意图；右：胆道梗阻性疾病iso-ALP电泳图谱
SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白 质负载了大量负电荷，大大超过了天然 蛋白质的原有电荷，因此蛋白质之间原 有电荷的差异就无显著效应，蛋白质带 电量的多少，只与蛋白质大小即分子量 有关，此时，不同泳动速率仅反映了各 蛋白质亚基的分子量的差别。
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-7 非浓缩尿蛋白电泳 示意图
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱 左：肾小球性蛋白尿； 中：肾小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型； 右：混合型蛋白尿
一个条带中仍是混合着多种蛋 白质，如何再把它们分开呢？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
区带电泳
A
B
C
D
图6-2 几种常见异常血清蛋白图谱 A：双清蛋白血清电泳图；B：慢性肝病或肝硬变常见的-融 合的桥连现象；C：免疫球蛋白寡克隆增生型；D：M蛋白血 清型（IgA型）；N：正常对照血清；P：患者血清
蛋白质分子为两性电解质 等电点 pH>等电点 带负电 pH<等电点 带正电
基本原理
质点所带净电荷量越多（介质的pH值离等电点越远） 质点的直径越小 越接近球形 则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。
区带电泳
• 检验医学中的应用－－血清蛋白电泳
Alb：清蛋白 α1：α1酸α脂蛋白 β：运铁蛋白、补体系统、β脂蛋白 γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE
第四节 二维电泳
图 6-9 二维电泳原理及流程图
第四节 二维电泳
• 基本原理
第一维电泳，即等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)其基本原理是利用蛋白质分子 等电点的不同对其进行分离；
第二维电泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)，使电泳迁移率主要取决于蛋白 质或亚基分子量的大小。
区带电泳
• 实验原理 让pH>pI（max） 所有蛋白质带负电 各种蛋白质带电量不同 电泳速度不同 经过一段时间电泳后，各种蛋白质被区分开
区带电泳
Alb：清蛋白 α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶 α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白 β：运铁蛋白、补体系统、β脂蛋白 γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE
• 免疫印迹法（Immunoblotting） 又称蛋白质印迹(Western blot) ，因与早先
建立的检测核酸的Southern blot 相类似，亦被 称为Western blot，是一种借助特异性抗体鉴定 抗原的有效方法。被检测物是蛋白质，“探针” 是抗体，“显色”用标记二抗。
第五节 印迹技术
质，使pH值从正极向负极渐次增加，形成一线性 pH梯度。
蛋白质混合物加入有pH梯度的电泳管中，在电 场中经一定时间后，混合物中各组分将分别聚焦在 与各等电点相应的pH介质区域，形成分离的各种蛋 白质区带。这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基本 原理。
第三节 SDS-PAGE电泳
• 等电聚焦根据等电点将蛋白质分离
共分三个阶段进行
– SDS-PAGE – 电转移 – 酶免疫定位
第五节 印迹技术
• 免疫印迹法在检验医学中的应用
– 自身抗体检测中的应用
第五节 印迹技术
图 6-14 免疫印迹法在自身抗体ENA检测中的应用
第六节 免疫电泳
电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了 其临床应用的范围，于1953年Grabar和Williams 首次将凝胶扩散置于直流电场中进行，让电流 来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向， 并与免疫沉淀反应相结合,该技术有两大优点， 一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白 组分利用其带电荷的不同而将其分离开，再分 别与其对应抗体反应，以此作更细微的分析。
• 那还能不能根据其他性质将蛋白质分离?
• 区带电泳的电泳速度的影响条件较多 （大小、电荷、形状），不是根据单一 性质分离
• 有一种方法能根据蛋白质的分子量使之 带上相应的电荷，远远大于蛋白质本身 电荷的大小，并使电荷成为电泳速度的 主要决定因素，那么电泳速度只和分子 量相关
第三节 SDS-PAGE电泳