实验十二 渗透胁迫与脯氨酸积累
水分胁迫对3个枣品种脯氨酸含量的影响
水分胁迫对3个枣品种脯氨酸含量的影响水分胁迫是指植物由于环境干旱等原因而无法正常吸收和利用水分，导致生长和发育受到抑制的一种应激状况。
枣（Ziziphus jujuba Mill.）是一种重要的果树，具有较强的耐旱性，但是长期的干旱条件仍会对其生长和产量产生不利影响。
脯氨酸（proline）是一种重要的保护性氨基酸，具有抗氧化、抗胁迫和维持细胞渗透调节等功能。
本文将研究水分胁迫对3个枣品种脯氨酸含量的影响。
本实验选取了3个枣品种，分别为“红枣1号”、“河南枣”和“大枣”，进行水分胁迫处理。
实验组和对照组分别为胁迫组和正常灌溉组，每个品种各设4个重复。
实验开始的前2周，所有的实验组和对照组的枣树都接受正常的灌溉处理，以保证各品种在开始时具有相似的水分状态。
然后，对胁迫组进行水分胁迫处理，每隔3天测量土壤水分含量，当土壤水分含量降低到对照组的70%左右时，开始胁迫处理。
胁迫持续3周，期间每天对胁迫组和对照组进行测量记录。
实验结束后，收集每个品种的叶片样本，测定脯氨酸的含量。
测定方法采用二巯基茚法，通过测定样品中脯氨酸和二巯基茚生成的蓝色化合物的吸光度来计算脯氨酸的含量。
实验结果显示，水分胁迫对三个品种的脯氨酸含量均有显著影响。
在胁迫组中，脯氨酸含量显著高于对照组。
“红枣1号”脯氨酸含量的增加最为显著，相较于对照组增加了38.3%；“河南枣”的脯氨酸含量增加了32.8%；“大枣”的脯氨酸含量增加了26.7%。
这表明水分胁迫会刺激枣树产生更多的脯氨酸来应对干旱胁迫的压力。
水分胁迫引起脯氨酸含量增加的原因可能是由于干旱环境下枣树生理代谢的变化。
脯氨酸是一种抗氧化剂，可以帮助减少细胞内部的活性氧物质的累积，保护细胞不受氧化伤害。
水分胁迫会导致细胞内部的氧化物质积累，激活一些抗氧化酶的合成，从而促使脯氨酸的合成。
脯氨酸还可以调节细胞内的渗透压平衡，帮助维持细胞的稳定性和抗干旱能力。
水分胁迫会显著增加枣树的脯氨酸含量，以增强其对干旱环境的适应能力。
盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响
一、实验课题名称：盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响二、文献综述：[1]作物生长的环境并不总是适宜的。
干旱、炎热、霜冻、盐碱、涝灾，以与环境污染、病虫害等都会对作物的生长造成不利的影响。
作物的抗逆性是整体性的。
可能存在着共同的机制以抵御整个生育期的各种逆境胁迫，现综述如下l．渗透调节己有大量研究表明，渗透调节是抗旱性的一种重要机制。
水分亏缺条件下，叶片和根系渗透调节的生理效应主要是以下两个方面：一是增加吸收，保持膨压，缓和脱水胁迫，改善细胞水分状况；二是改善水分胁迫植物的生理功能，维持一定的生长和光合能力，提高植物在低水势下的生存能力。
Jordan〔1984〕试图从植株整体系统上量化渗透调节的作用，他们用模型模拟得出如下结论，渗透调节的作用并不能找出影响产量的复杂因素，在干旱条件下由于缺乏渗透调节能力，小麦虽然有大量的根系仍不能正常生长〔Mcgown，l984〕。
李德全等〔1994〕在盆栽试验条件下研究表明，抗旱性强的品种渗透调节能力均大于抗旱性弱的品种。
李秀菊〔1992〕在大田试验条件下，测定了3个抗寒性不同冬小麦品种越冬期抗寒力变化与渗透调节的关系。
结果表明，抗寒锻炼期间冬小麦抗寒能力逐渐提高，抗寒性越强的品种增强的幅度愈大。
伴随抗寒力的增强，渗透势降低，抗寒力愈强的品种下降幅度愈大。
与渗透变化有关的可溶性糖等渗透物和水分状况均向降低渗透势的方向发展。
2．脯氨酸有研究表明，通常萎蔫较快的作物脯氨酸积累也较快。
Aspinall和Paleg(1987〕讨论了胁迫条件下脯氨酸积累作为一个抗旱因素的可能性，得出结论如下，脯氨酸是一种细胞亲和溶质，积累数它可影响渗透调节。
换句话说，对液泡中主要渗透物质钾的积累来讲，脯氨酸起细胞质渗透调节平衡作用。
Barderska〔1993〕认为，脯氨酸可能在防止酶蛋白脱水和渗透胁迫方面起一定的作用，因而把它看做对植物有利的反应，有人还提出把它作为作物抗旱育种的指标，但是后来倾向认为，这是植物受到胁迫损害的一种症兆，而且Bawa和Sen〔1993〕指出，有些能很好适应水分胁迫的植物并不总是积累大量的脯氨酸。
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果本实验的目的是测定植物中脯氨酸的含量。
脯氨酸是一种非常重要的氨基酸，它在植物中起着调节渗透压、抗逆性、保护细胞膜完整性等多种生理功能。
因此，测定植物中脯氨酸含量对于研究植物生理学和生物化学具有重要意义。
实验所需材料和仪器设备有：植物组织样品、乙醇、脯氨酸标准物质、离心机、溶液混合器、超声波清洗器、显微管、比色皿、分光光度计等。
实验步骤如下：1.准备样品：收集植物样品后，在洁净条件下取样品约10克，稍微清洗并切碎成小片，以利于提取脯氨酸。
2.浸提脯氨酸：将植物样品放入超声波清洗器中，加入适量的乙醇，使乙醇能充分接触到样品。
使用超声波清洗仪提取样品中的脯氨酸，提取时间为30分钟。
3.离心处理：将乙醇提取液离心10分钟，将上清液转移至显微管中。
4.标准曲线的制备：取不同浓度的脯氨酸标准物质，分别加入适量的乙醇，制备不同浓度（如0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）的标准品溶液。
5.比色测定：取0.2~1.0 mL标准品溶液，分别加入10%冰醋酸溶液（2.3 mL），然后加入15%草酸溶液（2.5 mL），混合均匀。
再加入0.2%法拉第试剂（0.2 mL），充分混合，并静置15分钟。
测量样品的最大吸收波长为535 nm。
6.吸光度测定：使用分光光度计进行吸光度测定，按照比色皿中的液体，即可得到对应吸光度值。
7.测量样品中脯氨酸的含量：根据标准曲线上的吸光度值，可以通过光谱仪测得样品溶液的吸光度值，然后将其代入标准曲线中计算脯氨酸的含量。
通过以上步骤，我们可以测定植物中脯氨酸的含量。
实验的结果按照以下格式进行记录：表1植物样品中脯氨酸含量的测定结果样品编号吸光度值脯氨酸含量(mg/mL)--------------------------------10.320.120.450.230.520.340.570.450.620.5通过实验测定的结果，我们可以发现不同植物样品中脯氨酸含量的差异，并进一步探究其对于植物生长和生理功能的影响。
植物生理学实验
植物生理学实验实验名称：盐分胁迫条件下植物的生理变化姓名：学号：系别：班级：实验日期：2012.12.12同组姓名：实验报告内容一、摘要脯氨酸积累是植物体抵抗盐胁迫的有效方式之一。
植物体内的游离脯氨酸可以用磺基水杨酸提取。
酸性条件下，脯氨酸可与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在波长为520nm处有一最大吸收峰。
用甲苯萃取红色产物后，在520nm波长下，吸光度与溶液中红色产物的含量成正比。
本实验利用在正常供水和干旱胁迫条件下生长的蚕豆和小麦新鲜叶片，通过对等质量叶片脯氨酸含量的测定，研究盐胁迫条件下植物的生理变化。
二、实验原理在盐胁迫下，由于细胞外的水势低于胞内，细胞不仅不能吸收到水分，而且内部水分会向外倒流，引起细胞的失水。
为保持胞内的水分，维持细胞的正常生理代谢，细胞通过渗透调节，降低胞内水势，使水分的跨膜运输朝着有利于细胞生长的方向流动。
参与渗透调节的有机渗透调节物质主要是脯氨酸、可溶性糖等。
脯氨酸积累是植物体抵抗渗透胁迫的有效方式之一。
脯氨酸的增高能够降低叶片细胞的渗透势，防止细胞脱水；脯氨酸具有很高的水溶性，可以保护细胞膜系统，维持细胞内酶的结构，减少细胞内蛋白质的降解。
植物体内的游离脯氨酸可以用磺基水杨酸提取。
酸性条件下，脯氨酸可与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在波长为520nm处有一最大吸收峰。
用甲苯萃取红色产物后，在520nm波长下，吸光度与溶液中红色产物的含量成正比。
三、实验目的获得脯氨酸的标准曲线。
掌握测定游离脯氨酸的方法，研究盐胁迫时植物的生理变化。
四、实验器材和试剂：（1）脯氨酸的测定实验器材：分光光度计、水浴锅、分析天平、容量瓶、研钵、滤纸、漏斗、25ml具塞刻度试管15支、移液管。
实验试剂：3%磺基水杨酸水溶液、甲苯、冰醋酸、2.5%酸性茚三酮显色液、脯氨酸标准溶液（2）盐胁迫实验实验器材：分光光度计、水浴锅、分析天平、容量瓶、研钵、滤纸、漏斗、25ml具塞刻度试管15支、移液管。
论脯氨酸累积与植物抗渗透胁迫
论脯氨酸累积与植物抗渗透胁迫脯氨酸累积与植物抗渗透胁迫：一种复杂的相互关系脯氨酸是植物体内的一种重要氨基酸，具有调节渗透胁迫、保护膜结构、维持氮代谢等重要作用。
植物在面对环境压力、病虫害等逆境条件时，常常会积累脯氨酸来增强抗性。
渗透胁迫是植物经常面临的一种环境压力，会导致植物体内水分失衡，影响植物生长和发育。
本文将探讨脯氨酸累积与植物抗渗透胁迫之间的关系，以期为提高植物抗逆境能力提供理论支持。
脯氨酸的合成途径主要包括谷氨酸途径、天冬氨酸途径和亚硫酸途径。
在逆境条件下，植物会通过增加脯氨酸合成酶的活性来促进脯氨酸的合成。
同时，脯氨酸的累积还受到植物激素如ABA、ETH等调节，以及一些逆境相关基因的表达调控。
植物在面对渗透胁迫时，脯氨酸的累积有助于提高植物细胞的渗透调节能力，保护膜结构和功能，增强植物的抗性。
脯氨酸的累积对植物抗渗透胁迫具有重要影响。
脯氨酸的累积有助于提高植物细胞的渗透调节能力，帮助植物在渗透胁迫条件下维持细胞内外水平衡，减轻水分缺失对植物生长和发育的影响。
脯氨酸的累积可以保护膜结构，减少渗透胁迫引起的膜损伤和离子泄漏，维持膜的稳定性和功能。
脯氨酸还可以通过影响一些逆境相关基因的表达，如ABA合成酶基因、热激转录因子等，进一步调控植物的抗渗透胁迫能力。
脯氨酸代谢相关基因表达对植物抗渗透胁迫的调控植物在面对渗透胁迫时，脯氨酸的合成和降解相关基因的表达会发生变化。
脯氨酸合成酶基因的表达会受到植物激素如ABA的调节，而在渗透胁迫条件下，ABA的合成和信号转导途径被激活，进而诱导脯氨酸合成酶基因的表达，促进脯氨酸的合成。
一些逆境相关基因如热激转录因子也会受到脯氨酸的调控。
热激转录因子可以响应多种逆境信号，包括渗透胁迫，并诱导相应的逆境防御基因的表达，以增强植物的抗性。
脯氨酸累积与植物抗渗透胁迫之间存在着密切的关系。
脯氨酸的累积有助于提高植物细胞的渗透调节能力，保护膜结构和功能，增强植物的抗渗透胁迫能力。
脯氨酸在植物生长和非生物胁迫耐受中的作用
维普资讯
生 技 术 讯 … Ｌ ｒ ＲＳ Ｉ Ｏ ＥＣ Ｅ， Ｎ ＢＩ Ｔ ＨＮＣＬ ，Ｅ ｒ ｌＯＧＹ Ｖ ｌ Ｎｏ Ｊ ｎ，２ ０ ｏ ８ － ａ ２ ｆ ・ －． １ 一 ・ １ 一Ｊ ． ０ ７ ・ ， ｒＩ
渗透胁迫下多花黑麦草叶内过氧化物_省略_脯氨酸含量以及质膜相对透性的变化_刘宁
收稿 1998-11-09 修定 1999-04-231 国家自然科学基金资助课题(编号39470128)。
2 联系人。
渗透胁迫下多花黑麦草叶内过氧化物酶活性和脯氨酸含量以及质膜相对透性的变化1刘 宁 高玉葆2贾彩霞 任安芝(南开大学生命科学学院,天津300071)Changes in POD Activity,Free Proline Content and Cytomembrane Per -meability of Lolium multi florum Leaves Under Different Levels of Os -motic StressLIU Ning,GAO Yu -Bao,JIA Ca-i Xia,RE N An -Zhi (Colle ge of Li f e Science,N ankai University ,Tianjin 300071) 提要 多花黑麦草幼苗于3叶期转移至1/2Hoagland 溶液中培养,同时加入PEG 6000用以模拟5种强度的渗透胁迫。
植物叶内过氧化物酶活性、游离脯氨酸含量和质膜相对透性均对渗透胁迫强度的增加作出了反应,但反应的敏感性依次降低。
从时间进程上看,过氧化物酶活性升降在前,游离脯氨酸积累继之,嗣后出现质膜相对透性增高。
每个测定日内叶片中游离脯氨酸含量与质膜相对透性呈显著至极显著正相关。
关键词 渗透胁迫 过氧化物酶 游离脯氨酸 质膜相对透性逆境导致的氧化胁迫是绿色植物中存在的一种普遍现象[1],水分亏缺引起的氧化胁迫尤其引起人注意,并有大量报道[2]。
植物的抗氧化作用是植物自身适应性调节的一个重要方面。
植物抗氧化的酶保护系统研究主要集中在超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(C AT)上,而对过氧化物酶(POD)的研究相对较少。
自Smirnoff 和Cumbes[3]证实外源脯氨酸具有清除活性氧的作用以后,人们对脯氨酸积累与抗氧化作用的关系也给予了极大关注。
脯氨酸在植物生长和非生物胁迫耐受中的作用
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［ 6#7 0%*1’］ ".23IL0D -VI2/IKD MIGL-3ILG "-/QW-ND G0L0 0LGIL00.ILG 脯氨酸是目前所知分布最广的渗透保护物质， 动物、 植物、 真菌、 藻类中都有脯氨酸的累积。在干旱、 高盐、 高温、 冰冻、 紫外 线以及重金属等胁迫条件下，脯氨酸合 成 的 增 加 和 降 解 的 减 少 会导致植物体内脯氨酸大量累积，植物 通 过 提 高 体 内 脯 氨 酸 的 含量调节渗透平衡， 从而保护细胞的结构， 很多实验证明脯氨酸 的累积与植物对环境胁迫的耐受能力正 相 关 ， 但 对 脯 氨 酸 在 植 物发育中的作用以及非生物胁迫过程中 脯 氨 酸 累 积 的 分 子 机 理 的研究还不是很透彻，研究植物应对胁 迫 的 分 子 机 理 为 运 用 基 因工程手段提高作物胁迫耐性提供了可能。迄今， 大部分编码与 脯氨酸合成、 降解有关的酶的基因已被克隆 ， 有些基因的功能也 得到了鉴定， 但调节这些酶表达的因子大部 分 还 没 有 鉴 定 出 来 ； 还有很多实验通过转入与脯氨酸生物合 成 有 关 的 酶 的 基 因 的 方 法提高了植物中脯氨酸的累积量，有些 转 基 因 植 物 表 现 出 对 非 生物胁迫的耐性。本文概要介绍了脯氨 酸 在 植 物 生 长 和 耐 受 非 生物胁迫中的作用、 与植物脯氨酸累积有关 的 信 号 转 导 、 胁迫条 件下脯氨酸的吸收和器官间的运输途径 ， 以 及 通 过 转 基 因 技 术 过量表达脯氨酸提高植物胁迫耐性的代谢工程的进展。
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经甘露醇处理 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml 沸水浴中显色 45min 冷却后加入 4 ml 甲苯
未经甘露醇处理 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
旋涡混合仪上振 0.5 min 静置分层，吸取红色甲苯相 波长 520 nm 测定 OD 值 测定对象 OD520 脯氨酸浓度 经甘露醇处理 未经甘露醇处理
实验十二
渗透胁迫与脯氨酸积累
【实验目的】
了解植物体内水分亏缺与脯氨酸积累的关系
【实验原理】
脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可 和蛋白质结合， 亲水端可与水分子结合， 蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水， 从而防止渗透胁迫条件 下蛋白质的脱水变性。因此，脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内， 脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高， 但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫 的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。 植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色 产物，该产物在 520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的 专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物， 碱性氨基酸对这一反应有干扰， 但加 入人造沸石，在 pH1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨 酸，精氨酸等 2-氨基的氨基酸）。
加入项 材料[地上部（芽鞘和叶子）] 材料实际质量 3%磺基水杨酸
经甘露醇处理 0.5 g 5 ml 研磨提取未来自甘露醇处理 0.5 g 5 ml
匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取 10 min 冷却后，3000 r/min 离心 10 min 取上清液待测
加入项 对应反应液 3%磺基水杨酸 冰醋酸 2.5%茚三酮
3)
取地上部（芽鞘和叶子）0.5 g，用 3%磺基水杨酸 5 ml 研磨提取，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提 取 10 min，冷却后，3000 r/min 离心 10 min，取上清液待测。另取未经甘露醇处理的材料同样制得提 取液待测。
2/4
4)
各取 2 ml 两种上清液，分别加入 2ml 蒸馏水，2 ml 冰醋酸和 4 ml 2.5%酸性茚三酮试剂，置沸水浴中 显色 45min，冷却后加入 4 ml 甲苯盖好盖子于旋涡混合仪上振 0.5 min，静置分层，吸取红色甲苯相， 于波长 520 nm 测定 OD 值，最后从标准曲线查得脯氨酸含量。
加入项 10μg/ml 脯氨酸 去离子水
0μg/ml 标准液 0ml 5 ml
2μg/ml 标准液 1 ml 4 ml
4μg/ml 标准液 2 ml 3 ml
6μg/ml 标准液 3 ml 2 ml
8μg/ml 标准液 4 ml 1 ml
加入项 对应标准液 3%磺基水杨酸 冰醋酸 2.5%茚三酮
0μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
【器材与试剂】
实验仪器
可见光分光光度计，低速离心机，水浴锅，旋涡仪，研钵，烧杯，移液管，容量瓶，
具塞试管，冰醋酸，人造沸石。
实验试剂
冰醋酸，甲苯，3% 磺基水杨酸，0.3 mol/L 甘露醇（54.65g 甘露醇溶于 1000 ml 蒸馏
水中），10μg/ml 标准脯氨酸溶液（1mg 脯氨酸溶于 100 ml 80%乙醇中，浓度为 10μg/ml），酸性茚 三酮试剂[2.5 g 茚三酮置于 60 ml 冰醋酸和 40 ml 6 mol/L 磷酸中（见附录表 1），加热（70℃）溶解。 试剂 24 h 内稳定]。
实验材料
小麦种子
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【实验步骤】
1) 取小麦种子于 25℃室温中黑暗浸泡 6 h，播于铺有湿滤纸的培养皿中于室温中黑暗培养。露白后于尼 龙网架上，用水培养 24 h，一组移至 0.3 mol/L 甘露醇中进行培养，另一组仍留在水中继续培养。在 甘露醇中培养至第 3~4 d 的幼苗，取地上部分用作实验材料。培养的时间越长，积累的脯氨酸也愈多， 胁迫效果也愈明显。
2μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
4μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
6μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
8μg/ml 显色液 2 ml 2 ml 2 ml 4 ml
沸水浴中显色 45min 冷却后加入 4 ml 甲苯 旋涡混合仪上振 0.5 min 静置分层，吸取红色甲苯相 波长 520 nm 测定 OD 值 脯氨酸浓度 OD520 0μg/ml 2μg/ml 4μg/ml 6μg/ml 8μg/ml
【注意事项】
一般在处理 24 h 即已显现脯氨酸含量增加，处理的时间越长，则效果愈显著。
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【实验结果及计算】
C V
脯氨酸含量（μg/g FW）=
W
A 100
式中：C ＝从标准曲线上查得脯氨酸微克数； V ＝提取液总体积（毫升）； A ＝测定时取用提取液毫升数； W ＝样品干重（克）。 样品中脯氨酸含量用 μg/g FW 表示。
2)
制作标准曲线：用 10μg/ml 脯氨酸配制成 0、2、4、6、8μg/ml 的标准溶液。取标准溶液各 2 ml，加 2 ml 3%磺基水杨酸，2 ml 冰醋酸和 4 ml 2.5%酸性茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色 45min， 冷却后加入 4 ml 甲苯盖好盖子于旋涡混合仪上振 0.5 min， 静置分层， 吸取红色甲苯相， 于波长 520 nm 测定 OD 值，以 OD 值为纵坐标，脯氨酸浓度(μg/ml)为横坐标绘制标准曲线。
【思考题】
(1)根据实验结果，分析干旱或盐分胁迫与植物体内游离脯氨酸积累之间有何关系？
(2)为什么用茚三酮作显色剂要在酸性条件下起反应？目的是什么？
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