缺失外壳蛋白羧端155-158序列对TMV侵染性的影响

缺失外壳蛋白羧端１５５－１５８序列对ＴＭＶ侵染性的影响
摘要:对野生型TMV-U1的外壳蛋白羧端进行缺失突变，观察到外壳蛋白羧端序列缺失4个氨基酸(即外壳蛋白保留154个氨基酸)的TMV154TAG能较强地系统侵染烟草，并高水平表达外壳蛋白，经过二次转接新烟草植株仍保持较强的系统侵染状况，复制完整病毒粒子。

结果说明外壳蛋白羧端序列4个氨基酸序列的缺失对烟草花叶病毒感染和复制无严重影响，对利用外壳蛋白羧端缺失型病毒载体表达外源多肽技术具有一定的应用价值。

关键词:烟草花叶病毒;外壳蛋白;羧端缺失;侵染性;外源肽
烟草花叶病毒属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，其基因组是带有帽子结构的正义单链RNA，全长6 395nt。

TMV至少编码了4种蛋白质:126/183ku的两种复制酶､30ku的运动蛋白(movement protein，MP)和17.5ku的外壳蛋白(coat protein，CP)[1]。

TMV系统感染敏感性烟草后，CP表达量可达到被感染烟草总蛋白的7%，CP亚基含有158个氨基酸，由4个α螺旋组成，蛋白的N端和C端暴露在外部[2]，因此常利用病毒CP基因融合技术表达可产生大量的融合外源肽，并且展示在TMV的外侧。

基于江陆斌利用TMV载体表达外源肽方面的重要发现[3]和表达外源长肽的需要，前期对系列缺失型TMV病毒侵染的研究[4]，本试验旨在通过对外壳蛋白缺失4个氨基酸的TMV154TAG侵染情况进行重点研究，来推动缺失型TMV病毒载体表达外源多肽的应用研究，于是对已构建的CP羧端缺失型TMV病毒载体，经过体外转录后感染Nicotiana tabaccum cv. Samsun nn，并且经二次转接新烟草植株，就感染情况进行不同层面的观察和检测。

1材料与方法
1.1试验材料
酶与试剂所用工具酶购自Fermentas公司和上海生物工程技术有限公司，试剂购自国药集团上海分公司，质粒pTMV154TAG由本实验室构建[4]。

供试烟草Nicotiana tabaccum cv. Samsun nn生长在温室中，人工光照12 h•d-1。

培养4~6周时用于病毒接种。

在接种前2~3 d，移至温室。

1.2试验方法
1.2.1体外转录与接种对pTMV154TAG线性化，并体外转录得到突变病毒TMV154TAG的全长RNA[5]，以野生型RNA为对照，用机械摩擦接种法分别将
RNA接种于烟草叶片上;并使用已感染病毒的烟草顶叶研磨液第2次侵染新苗。

1.2.2RT-PCR检测提取第2次侵染新苗后新生顶叶的总RNA为模板[6]，用引物SQ3(+)[4]和Pst (-)[4]进行RT-PCR扩增，扩增产物1kb用于测序。

1.2.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)制备感染烟草叶片的可溶性蛋白粗提液，实施15% SDS-PAGE[5]。

1.2.4突变病毒粒子纯化及电镜检测参照Aileen等[7]的方法，提取并纯化病毒粒子，以供电镜JEM-200CX(日本JOEL)观察。

2结果与分析
2.1RT-PCR对病毒RNA的检测
为检测TMV154TAG在烟草体内的长距离迁移和复制情况，对新叶进行了病毒RNA和已感染顶叶研磨液二次感染烟草后新叶的病毒RNA在不同的时段进行了RT-PCR检测，结果显示，TMV154TAG的基因组RNA在所有接种的烟草新叶里都能检测到(图1)。

对lane6所示的扩增片段(约1kb)纯化测序表明，TMV154TAG进行长距离迁移并能正确稳定地复制，无回复突变。

2.2二次感染新叶外壳蛋白SDS-PAGE结果
为检测CP羧端缺失对病毒在新叶外壳蛋白表达的影响，以及转接感染有无衰弱的变化，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测(图2)，前期CP蛋白印迹杂交试验[4]已经确认缺失型CP正确表达。

SDS-PAGE结果显示，不论TMV154TAG初次感染烟草，还是利用已感染烟草顶叶研磨液第二次侵染新苗，都能在顶叶中检测到大小约17 ku的CP，只是其电泳迁移率较野生型CP稍快，通过内参Rubisco 大亚基表达情况，可以观察到二次感染新叶中CP持续的表达量与野生型相当。

2.3感染后新生叶中病毒粒子的电镜观察结果
为了检测CP的羧端缺失对于TMV是否能形成完整粒子并稳定传代，对初次感染烟草的新叶(B)以及二次感染的新叶(C)分别提取纯化病毒粒子后进行透射电镜观察(图3)，结果都发现TMV154TAG完整粒子，外观形态都与野生型相似(A)，说明TMV154TAG能完好复制并稳定传代。

3讨论
通过X射线单晶衍射技术对CP观察，发现CP的最后4个氨基酸对于整个蛋白三维结构的作用不明显[8]，本试验中，初染和二次转接侵染检测以大量数据确切表明，烟草花叶病毒TMV-U1株系的CP羧端缺失155-158的4位氨基酸时，TMV154TAG能对烟草产生较强的系统感染，新叶出现与野生型相似的绿色花斑，并大量表达外壳蛋白，所产生的病毒颗粒的形态与野生型病毒并无明显差别。

此外，感染后的新生叶粗提物二次感染新苗后，其病毒的基因组RNA和CP 均能够在二次感染的新生叶中检测到高表达的外壳蛋白表达水平，并能稳定复制完整病毒粒子，无回复突变，这都说明TMV-U1株系CP羧端的4位氨基酸缺失并不影响TMV的基因组复制､包装､感染和长距离运输(系统感染)。

此现象出现也引发我们对外壳蛋白羧端序列功用性的思考，在不影响TMV 病毒的复制､系统感染方面之外，4位氨基酸究竟对于古老的烟草花叶病毒有何生物学的意义。

基于对155-158序列缺失影响的认识，对上游氨基酸作了更深入研究[4]。

现在利用的TMV病毒载体表达外源肽，多选择在CP的羧端154与155之间插入外源序列，且保留羧端的4个氨基酸采取融合的方式表达抗原短肽[9]，使插入的外源序列暴露于病毒粒子外部，对于后期的纯化带来不便。

根据表达和纯化外源肽的技术需要[7]，本结果将推动缺失型TMV病毒载体表达外源多肽的应用研究，且无需保留病毒CP羧端序列，并高效表达外源多肽。

参考文献:
[1]GOELET P，LOMONOSSOFF G P，BUTLER P J G，et al. Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1982，79:5818-5822.
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[3]LUBIN JIANG，QIAOLI LI，ZHENGKAI XU. A modified TMV-based vector facilitates the expression of longer foreign epitopes in tobacco [J]. Vaccine，2006，24:109-115.
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