PCR介导的定点突变与随机突变的应用

随 机 突 变 ＰＣＲ 的 优 点 之 一 是 在 无 需 分 离 克 隆和获得序列信息的情况下， 可以对核酸群体进 行重复随机突变。得到突变体库以后筛选出有特 殊性质的个体， 该个体还可直接用作第二次突变
ＰＣＲ 的模板， 连续反复地进行随机诱变， 使每一次 获得的小突变累积而发生重要的有益突变。
［参考文献］
任桂杰， 等 ． ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
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合酶进行不正确拷贝时随机引入突变。通过调整 核苷酸、酶及镁离子的用量， 获得无序列倾向性的 突变体库。
随机突变 ＰＣＲ 应使用 ｃＤＮ源自 或仅含有目的序 列的双链 ＤＮＡ 片段作模板， 一般不用质粒 ＤＮＡ， 也不用基因组 ＤＮＡ。随机突变 ＰＣＲ 方 法 对 模 板 ＤＮＡ 的长度限制在约 １０００ 核苷酸。对于较长靶 ＤＮＡ 的突变， 可将其分为若干片段分别进行。
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（编辑：孙玉芝）
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任桂杰 １， ２ ， 王志玉 １
（ 山东大学 １．公共卫生学院病毒学研究室； ２．医学院生化与分子生物学研究所，山东 济南 ２５００１２）
［关键词］ 聚合酶链反应；定点突变；随机突变 ［中图分类号］ Ｑ７５４ ［文献标识码］ Ｂ
蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质 组学研究的重点内容之一。体外突变技术是研究 这种复杂关系的有力工具， 也是实验室中改造／优 化基因常用的手段［１］。定点突变技术可对某个已知 基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入； 随 机突变则可在特定编码序列的多个位点上产生随 机的突变体。我们现介绍两种在实验中总结出来 的用 ＰＣＲ 方法对克隆化 ＤＮＡ 进行定点突变和随 机突变的技术。
３．１ 定 点 突 变 体 外 定 点 突 变 技 术 是 一 种 功 能 强大的方法， 可用于对蛋白质功能的研究， 确定酶 的活性位点， 以及在药物筛选中设计新的蛋白等。 ＰＣＲ 介导产生定点突变体的设计与传统的定点突 变方法不同， 它无需单链 ＤＮＡ 中间物， 回避了使 用 Ｍ１３ 系 列 噬 菌 体 载 体 及 其 他 辅 助 病 毒 制 备 单 链 ＤＮＡ 的过程［３］， 从而缩短了实验所需要的时间。
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 克隆载体、目的基因和菌株 载体为 ｐＢ－ ＳＫ＋质粒 ＤＮＡ。基因克隆的重组质粒由美国麻省大 学 Ｉｏｒｉｏ 博士惠赠。新城疫病毒融合蛋白基因被插 入 ＸｈｏⅠ切点（ ６６８） ； 副流感病毒融合蛋白基因被 插入 ＢａｍＨⅠ切点（ ７１９） 。大肠杆菌 ＴＧ１ 由本室保 存。 １．１．２ 试 剂 Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ ５ Ｕ／μｌ， ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０１ＡＭ） ； 常规 １０×Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶缓 冲 液 ； ｄＮＴＰ 混 合 物 ； 天 然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （ Ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｓ 公司， ＃ＥＰ０２８１） 或 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶； 自配１０×致突变 ＰＣＲ 缓冲液： ７０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， ０．１％（ｗ／ｖ）明胶。１０×ｄＮＴＰ 混合物： ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＧＴＰ， ２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ， １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＣＴＰ 和 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＴＴＰ。５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２ （ 事 先 不 要 与 １０×致 突 变
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已 有 研 究 证 明［２］， 含 有 短 同 源 末 端 的 ＤＮＡ 片 段可以在 Ｅ．ｃｏｌｉ 胞内进行分子间重组， 即 ＰＣＲ 产 生的同源末端可通过体内重组使 ＤＮＡ 连在一起， 形成环状重组体。如果环状重组体分子含有复制 序列和选择标记， 那么这种重组体则更易于筛选。
点突变引物通常为 ２５～３５ 个核苷酸， 突变的 位置一般放在引物的中间。无突变的引物一般长 度为 ２０～３０ 个核苷酸。两种 ＰＣＲ 引物的末端最好 有 ２４ 个左右的同源核苷酸。突变体的设计最好是 消除或产生一个限制酶识别位点， 以便有效地筛 选出突变产物。此种定点突变方法构建的目的产 物特异性高， 但转化率低， 平均每纳克 ＤＮＡ 只产 生 １０ 个带突变的克隆。因此需用高度感受态的大 肠 杆 菌 （ 转 化 效 率 ＞１ ×１０９ 转 化 子 ／μｇ 单 体 ｐＵＣ１９） 。如果没有高度感受态的大肠杆菌， 那么 转化后 ３７ ℃复苏 １ ｈ， 可将全部样品涂在平板上， 可以提高筛选的效率， 节省实验时间。
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（ Ｎｏ．３０２７００６１） ［作者简介］ 任桂杰（ １９６９－ ） ， 女， 讲师， 主要从事分子病毒学的研究。 ［通讯作者］ 王志玉， Ｔｅｌ： ０５３１－８８３８０４１８．
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山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版）
ＤＮＡ， 酶切或双酶切反应初步鉴别突变株。然后送 公司测序， 进一步确定突变株。
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ｅｐｉｌｅｐｓｙ［Ｊ］． Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ （Ｒｉｏ Ｊ） ， ２００３， ７９： ２５９． ［６］ Ｐａｏｌｉｃｃｈｉ ＪＭ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｎｏｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ
３讨论
４３ 卷 ９ 期
图 １ 重组 ＰＣＲ 定点突变示意图
１．２．２ 随机突变方法［２］ 在预突变区域的两端按 常规方法设计引物， 为克隆方便也可在引物中加 入限制酶切位点。每 １００ μｌ 反应体系中， 分别加 入 １０ μｌ １０×致 突 变 ＰＣＲ 缓 冲 液 ， １０ μｌ １０×ｄＮＴＰ 混合物， 各种引物 ３０ ｐｍｏｌ 及 ＤＮＡ 模板 ２０ ｐｍｏｌ， 加入适量水使总体积为 ８８ μｌ， 混匀。加入 １０ μｌ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２， 混合均匀， 确证无沉淀产生后加 ５Ｕ 天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶， 使终体积为 １００ μｌ。混匀， 上层可覆盖矿物油或 ｗａｘ ｂｅａｄ。ＰＣＲ 循环 ３０ 次， 循环条件为： ９４ ℃ １ ｍｉｎ， ４５ ℃ １ ｍｉｎ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ。 不要进行热启动， 循环结束后也不要延长延伸时 间。氯仿／异戊醇（ ２４：１， Ｖ／Ｖ） 抽提后进行乙醇沉淀 以纯化 ＰＣＲ 产物。取少量纯化产物做琼脂糖凝胶 电泳分析， 证实获得满意量的全长 ＰＣＲ 产物。为 了比较全长 ＤＮＡ 的产量， 可将致突变 ＰＣＲ 和标 准 ＰＣＲ 同时进行， 然后电泳鉴定。将 ＰＣＲ 产物克 隆到适当载体后， 建立突变体库。从突变体库中筛 选出所需的突变体送公司测序， 确定突变体。
ＰＣＲ 扩增反应之前， 需用两种限制性内切酶 在质粒待扩增区域的两侧， 分别将模板质粒线性 化， 进行两次 ＰＣＲ 并引入突变。一般利用原始质 粒上单一酶切位点， 这样在插入物上任何位点进 行 突 变 时 ， 都 可 以 用 这 两 种 线 性 模 板 。超 螺 旋 的 ＤＮＡ 分 子 也 可 作 为 ＰＣＲ 的 模 板 ， 但 ＰＣＲ 产 物 必 需 经 过 纯 化 使 其 与 质 粒 模 板 分 开 （超 螺 旋 质 粒 转 化 效 率 非 常 高 ） 。由 于 超 螺 旋 模 板 的 ＰＣＲ 产 物 量 低 ， 因 此，超 螺 旋 质 粒 作 ＰＣＲ 模 板 时 要 进 行 多 次 的扩增循环。 ３．２ 随机突变 如果突变在长 ＤＮＡ 片段及在完 整基因中进行， 则更倾向于采用在整个序列中进 行散在的随机突变， 每一分子出现一个或数个突 变。由于天然 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶不具备 ３＇ →５＇ 外切 酶活性， 在链延伸过程中不可避免地存在一定的 核苷酸错误掺入， 所以可在 ＰＣＲ 中通过 ＤＮＡ 聚
第 ４３ 卷第 ９ 期 ２００５ 年 ９ 月
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ ＨＥＡＬＴＨ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）
文章编号： １６７１－ ７５５４（２００５）０９－ ０８６５－ ０３
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．９ Ｓｅｐｔ．２００５
ＰＣＲ 介导的定点突变与随机突变的应用
２结果
对副粘病毒融合蛋白进行的突变研究表明， 定 点 突 变 的 成 功 率 为 １００％； 随 机 突 变 （ ５００ 核 苷 酸 长度的靶 ＤＮＡ） 产生的突变群体中约 ４％为野生 型、１２％为含有 １ 个错误的突变体、２０％为 ２ 个错 误的突 变 体 、２２％为 ３ 个 错 误 的 突 变 体 、１８％为 ４ 个错误的突变体、１２％为 ５ 个错误的突变体、１２％ 为 ６ 个或更多错误的突变体。
ＰＣＲ 缓冲液混合， 否则会导致沉淀产生， 妨碍 ＰＣＲ 反应） 。 １．１．３ 定点突变引物 ①两对引物 （ 共 ４ 个） ， 每 对引物分别用于各自 ＰＣＲ 反应。每一引物约含有 ２４ 个与另一对引物中相应引物互补的核苷酸；② 测序引物， 在突变部位或插入部位的两侧， 用于分 析生成的构建体。所有引物均由上海生物工程有 限公司合成。 １．２ 方法 １．２．１ 定点突变方法［２］ 重组 ＰＣＲ 进行定点突变 的过程见图 １。引物由带数字的箭头表示。突出部 分代表错配碱基及 ＰＣＲ 产物中产生的突变。引物 １ 和引物 ３ 互补， 引物 ２ 和引物 ４ 互补。两种单一 限制性内切酶位点用于使质粒线性化。如要进行 另外的单一特异位点的突变， 只需合成新的引物 １ 和引物 ３， 可用同一种经酶切割的模板。５０ μｌ ＰＣＲ 反应体系中含 ２ ｎｇ 线性化的质粒 ＤＮＡ， 每种 引物 ２５ ｐｍｏｌ， 各种 ｄＮＴＰ ２００ μｍｏｌ／Ｌ， Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合酶 １．２５ Ｕ， １×ＰＣＲ 缓冲液， 在 反 应 体 系 表 面 加 ３０ μｌ 矿物油。ＰＣＲ 反应参数： 起始变性温度 ９４ ℃ １ ｍｉｎ， 循环条件（ 每 ｋｂ 长度的 ＰＣＲ 产物） 为 ９４ ℃ ３０ ｓ， ５０ ℃ ３０ ｓ， ７２ ℃ １ ｍｉｎ， 进行 １４～２０ 次循环。 循环结束后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎ。用琼脂糖凝胶电泳 检 查 ＰＣＲ 产 物 。 从 两 个 ＰＣＲ 反 应 管 中 各 取 出 ３ μｌ ＰＣＲ 反应产物， 混匀后用 ＣａＣｌ２ 转化法转化至 感受态大肠杆菌中。涂平板后， 从转化的细菌菌落 中随机挑选若干， 接种于含氨苄青霉素的 ２×ＹＴ 培养基中， ３７ ℃震荡培养， 进一步扩增。提取质粒