ch17植物基因转化受体系统
第五章 植物基因的遗传转化
主讲：胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。
用于转化的外植体（如发苗产生子叶、胚轴等）通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件（一）高效稳定的再生能力（二）较高的遗传稳定性（三）具有稳定的外植体来源（四）对选择性抗生素敏感（五）对农杆菌侵染有敏感性（一）高效稳定的再生能力从理论上讲，植物的任何体细胞都具有再生完整植（totipotency）但在组织培养的实践中，并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心（分生组织）和薄壁细易再生出植株。
再生频率必须具有好的稳定性和重复性。
植物转化频率一般情况下只有0.1%。
基因转化操作，如农杆菌侵染，使用抗菌素筛选及继代培养，都会使转化外植体再生频率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而难以形成植株。
若只有10%再生率，则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。
不因导入优良性状的目的基因，使原有的目的性状（优良性状）在后代发生了变异。
注意组培过程（组培方法，再生途径及外植体基因型）引稳定的外植体来源，即外植体容易得到并且可以大量提供。
因基因转化的频率很低，需要多项反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程，数量亦多；接种前的无菌处理简便易行；一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株；无需保持无菌苗的无性系，只要有种子，随时可大量培养已适应组织培养条件，有利于外植体转化生长；可直接采用、无需消毒；材料来源量大而稳定。
欧美杨107基因转化受体系统的建立
２０ ０ ７正
辽 宁 林 业 科 技
Ｊｕ ｌ ｆＬａ ｎｎ ｏｅｔ ｃｅ ｃ ｏ ｍａ ｉｏ ｉｇＦ ｒｓ ｙＳ ｉｎ ｅ＆ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｏ ｒ ｅ ｈ ｏｏ ｙ
２ ０７ ０ｒ
№２
第 ２期
欧美杨 １７ 因转化受体 系统 的建立 基 ０
２０ｍ以上 的幼苗分离 出单株 ， ．ｃ 插入生根培养基 中 （Ｓ Ｍ 附加不同浓度 ＩＡ或 ） Ｂ 诱导生根 。长 出不 定根后 ， 开瓶锻炼 ３ ｄ 小心洗去根部 的培 养基 ， —５ ，
感性的实验 ， 建立 了欧美杨 １ ０ ７稳定 高效的叶片再
栽入培养土（ 草炭土 ： 河沙 ＝ ：） ３ １中。用塑料薄膜覆
按 １２方法 获 得 叶 片 ， ． 接种 到附 加不 同浓 度 的 卡那霉 素 （、 、０ ｌ、０ ２ 、０ ｇ Ｌ 或潮 霉素 ０ ５ ｌ、５ ２ 、５ ３ｍ ・ ） （、 ．、、 ．、０ １、０ ｇＬ 的最 佳 叶片再 生 培 ０２５ ５７５ １、５ ２ｒ ・ ） ａ
还观察 到 ， Ｂ 在 Ａ与 Ｎ Ａ或 ＩＡ组 合 的培养基 中 ， Ａ Ｂ 多
２４０ ， １ 光周 期 １ｈｄ ０ｘ ６ ・ ～。 １３ 不定 芽继代 及 生根 、 ． 移栽
是我国 自己培育的黑杨新 品我国三北 防护林和人工林建设 中发 挥 了重要作用。若能结合基因工程手段对其进行种
质创新 ， 使该品种集更多 的优 良性状于一身 ， 可以进 步扩大其品种应用范围， 增加其应用价值。
Ｌ１姒 ＋ ％蔗糖 ＋ ．％琼脂的培养基中可直接再生不定芽， Ｉ ３ ０５ 再生频率达 １０ 平均再生芽数 ０ ％， 为４ 个以上。抗生素敏感性试验表 明， 可以选用 １ｒ ・ Ｉ的卡那霉素或 ５ ｇＬ １ ５ ｇＬ１ ａ ｍ ・ Ｉ的潮霉素进行抗
细胞工程第七章 植物转化受体系统
特点：
(1) 原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直 接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核；
(2) 通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞 克隆，从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少；
(3) 原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定 的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；
选择原则 ：
①同一物种的培养基有雷同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基 类型基本相同；
②同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同； ③植物组织培养时所需营养成分与田间栽培有相似性； ④MS培养基是大多数植物的通用培养基； ⑤无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参
的抗生素有一定的敏感性；要求抗生素对受体植物 没有严重的毒性；
（5）对农杆菌侵染有敏感性。
第一节 植物基因转化受体系统的类型及其特性
一、愈伤组织再生系统
愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并 通过分化培养获得再生植株的受体系统。
特点：
（1）外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，具有易 于接受外源基因的能力，转化率较高；
第七章 植物基因转化受体系统
本章所讲内容：
建立植物基因转化受体系统的基本条件； 植物基因转化受体系统的类型及其特性； 建立植物基因转化受体系统的程序及要求； 建立植物基因转化受体系统过程中的常见问
题及解决方案。
概述：
植物基因工程技术：即将目标性状基因分离出来， 构建重组DNA分子导入受体物种中，筛选出获得目 标基因表达后代，培育新品种，这种技术称为转化。
生理上的变化：
结构：茎尖分生细胞较小、结构简单，缺少 具正常功能的输导组织，叶片只有海绵组织， 气孔的保卫细胞功能失调等。
植物组织培养
名词解释：1.外植体：离体培养的器官、组织、细胞、细胞器称外植体。
2.细胞全能性：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。
3.脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。
一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
4.再分化:经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
5.继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。
6.植物组织培养：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。
7.MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。
特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。
其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。
它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。
有些培养基是由它演变而来的。
8.胚培养：植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。
在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养。
9.花粉培养：花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。
由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。
10. 细胞胚的发生：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成的具有双极性的胚状结构。
胚状体途径：非合子细胞通过与合子胚相似的胚胎发生过程形成的胚状结构，经过球型期、鱼雷期、心型期、子叶期发育过程的成熟胚状体可以萌发成为植株。
11.器官发生途径：外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成不定芽，最后不定芽伸长、生根培养形成小植株（间接途径）或者外植体不经过愈伤组织直接形成不定芽，再经伸长、生根培养形成植株（直接途径）。
植物基因转化受体系统
注意问题
直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物 选材：从组织类型上讲，子叶、叶片、胚轴和某些
营养变态器官通常比较容易诱导；从细胞状态上讲。 薄壁细胞状态外植体较容易诱导
原生质体再生系统
原生质体由于除去了细胞壁的屏障，能够直接高效 的摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核
适合于现在建立的所有转化方法
抗生素敏感性
为了便于转化子的筛选需要使用标记基因（如抗生 素抗性基因等）
选择性抗生素需满足的条件： （1）植物受体材料对所选用的抗生素具有一定的敏
感性； （2）抗生素对受体植物没有剧烈的毒性，不会很快
杀死植物细胞
对抗生素过度敏感或过度钝化的植物材料都不适合 于构建植物转基因的受体系统
不同的受体类型具有不同的缺点，适合的转化方法 也不同
实际操作中应根据受体的特性，基因转化方法，选 择适宜的受体系统
特点
外植体来源广泛 扩繁量大，可获得较多的转化植株 使用的植物范围广
从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特点，形成 嵌合体较多
再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳 定性较差
植物周倜系统接受外源基因后不影响吱声非改造遗 传体系
又能外源基因遗传给后代，保持其遗传的稳定性 同时选材时注意尽量减小受体系统体细胞变异的发
生
具有温度的外植体来源
由于基因转化频率低，实验重复较多，因此需要稳 定的外植体来源；
常用转化外植体：种子，无菌实生苗的胚轴、子夜 或幼叶，一些植物的试管苗，以及可较高频率诱导 的营养变态器官。
农杆菌敏感性
农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率高、多为 单拷贝插入等优点，是常用的植物基因转化方法；
植物基因转化
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Ti质粒结构
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T-DNA区：T-DNA是根瘤农 杆菌侵染植物细胞时从Ti 质 粒上切割下来转移到植物细 胞的一段DNA，含有编码植 物激素和冠瘿碱的基因
Vir 区：Vir 区上的基因 能激活T-DNA 转移，使 根瘤农杆菌表现出毒性
Con 区(接合转移编码区)：该 区段上存在与细菌间接合转移 的有关基因，调控Ti 质粒在农 杆菌之间的转移
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三亲交配法
无论是整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由 大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，通常把这 一过程称为三亲交配法。
1.受体农杆菌 2.协助菌（带有协 助质粒的大肠杆菌） 3.供体菌（带有重 组植物表达载体的 大肠杆菌）
原理：三种菌混合 时，协助质粒游动 进入供体菌中，将 供体菌中的表达载 体转移到受体菌中， 最后经过适当的抗 生素筛选即可获得 土壤农杆菌转化结 合体
RNA病毒载体 烟草花叶病毒 马铃薯病毒X
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9
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改造后的Ti质粒的基本结构
右边界序列 DNA复制起始位点 选择标记基因 T-DNA的边界序列 多克隆位点
左边界序列
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Ti质粒介导转化的过程
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植物表达载体构建—中间载体的构建
带有重组T-DNA的大肠杆 菌质粒衍生载体称为“中 间载体”。
基本原理是把T区（即Ti质粒能整合到植物基因组中去的一 段DNA，总长度约为23kb）片段克隆到普通载体pBR322 上，把外源基因插入到该T区后再导回受体细胞中，使外 源DNA转移到Ti质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该 外源片段导入植物体内。
Ori区(复制起始区)：Ori 区上的基因调控Ti 质粒 的自我复制
第10章 植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了 共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
9
农杆菌和基因枪转化的特点比较
2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。 操作简便。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点：
1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体 材料进行遗传转化操作，然后经过培养直接在 外植体上形成不定芽的情况。 这种系统的特点是 1）获得再生植株的所 需时间短，操作简单；2）遗传变异少；3）外 源基因稳定性高；4）嵌合体比例偏高；5）受 植物物种的限制比较大。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 5，生殖细胞受体系统
以花粉粒或卵细胞为受体细胞进行直接的 转化的技术系统，也叫种质系统。 5.1，花粉管通道法； 5.2，花粉粒浸泡法； 5.3，花粉粒基因枪转化法； 5.4，子房微注射法。
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第二节
转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
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第二节
转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受 体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。 农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌 株的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采 用化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不 足。
生菜基因转化组织培养受体系统的建立
Ｌ Ｂ培养基 ； ＭＳ培养基 ； 培养 培养 基 ： Ｓ＋乙 共 Ｍ
１ 材料与方法
１ １ 植 物 材 料 ．
酰丁香 酮 （ ０ｘ １ ４ ｔ ）＋６一Ｂ ＋Ｎ Ａ； 择 培 养基 ： ｍｏ Ａ Ａ 选
ＭＳ＋Ｋａ ｎ＋Ｃｅ／Ｃａ ｂ＋６一ＢＡ ＋ＮＡＡ。 ｆ ｒ
１ ４ 生菜再 生 系统 的建 立 ．
⑥
２ １ Ｓｉ ｅｈ Ｅ ｇｇ ０ ０ ｃ Ｔ ｃ． ｎｎ． ．
生菜基 因转化 组织培 养 受体 系统 的建立
罗 雯 孙 东妮 王 甜 王 钢
（ 安文 理 学 院 生命 科 学 系 ， 安 ７ ０ ６ ） 西 西 １０ ５
摘
要
以散 叶生菜大速 生（
脚 ｓｔ ａｖｔ ａａ ｔ Ｌ ） ａｉ ａ．ｅｐ ｔａ ． 为试材 ， ＭＳ为基本培养 基， ｖ ａ 以 采用不 同的激 素配比， 经愈伤组织
诱导、 芽分化、 生根、 移植入土四个步骤的离体培养 ， 获得 正常的再生植株 ， 建立 了散 叶生菜大速 生的基 因转化受体系统， 为下
一
步 的基 因转 化 工作 提 供 了有 利 条件 。高 效 诱 导 愈伤 组 织 培 养 基 为 ＭＳ＋ ． ｇ Ｌ６一 Ａ＋ ． ｍ ／ Ａ 高 效诱 芽 培 养 基 ０ ５ｍ ／ Ｂ ０ １ ｇ ＬＮ Ａ，
第１ Ｏ卷
第３ ４期
２１ ００年 １ ２月
科
学
技
术
与
工
程
Ｖ０ ０ Ｎ０ ３ Ｄｅｃ ２ ０ Ｌ１ ．４ Ｉ ０１
１７ — １ １ ｆ０ ０ ３ —３４ ０ ６ １ ８５ ２ １ ）４ ８８ —５
Ｓ ｉｎ ｅ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｎ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｃ ｅ ｃ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅ ｇｎ ｅ ｉ ｎ
植物基因工程
第六章 植物基因工程在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。
已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。
一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。
70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi 中的特定片段——T-DNA 转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。
人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。
农杆菌将自身的DNA 插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因课程基因工程原理与技术 班级 生物科学05 生物技术05 教师 詹亚光 范桂枝 学期第二学期 课时 6学时 上课日期 课的类型理论 授课章节 第六章 植物基因工程（1）植物基因转化受体系统的条件（2）植物基因转化受体系统的类型和特性。
（3）植物基因工程载体的种类和特性（4）根癌农杆菌Ti 质粒的结构与功能：T-DNA 、Vir 区操纵子的基因结构与功能。
（5）农杆菌Ti 质粒基因转化机理（6）农杆菌Ti 质粒的改造及载体构建（7）载体构建中常用的选择标记及报告基因（8）根癌农杆菌的转化程序及操作原理（9）外源基因在植物中的表达教学目的和要求 了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti 质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。
教材分析 重点 根癌农杆菌Ti 质粒介导的基因转化的原理和方法难点 植物载体构建原理关键点 转基因植物的获取和检测主要教具和设备材料 投影仪、电脑、常规教学设备教法 板书与多媒体授课相结合思考题 1. 植物基因工程载体种类？2. 根癌农杆菌转化程序？心得为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。
植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。
植物遗传转化的载体系统
2．植物遗传转化的载体系统。
作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。
目前的载体系统有病毒的载体系统和质位的载体系统两大类。
（1）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。
以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。
植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。
但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。
作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。
目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中；包括椰菜叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）和马铃薯X病毒（PVX）等。
其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。
（2）农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。
Ti 质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。
Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。
但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。
农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。
Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。
T-DNA长度为12-24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。
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特点
• 胚性细胞繁殖量大，同步性好，具有较强的 接受外源DNA的能力，转化率高 • 转化后胚性细胞可通过体细胞胚途径发育成 完整植株，嵌合体少 • 体细胞胚具有双极性，减少了不定芽发育途 径中的生根培养过程 • 来自同一体细胞胚的后代个体间遗传背景一 致胞如花粉粒和卵细胞为受体细胞进 行基因转化的系统称为生殖细胞受体系统， 也叫种质系统 途径：①利用小孢子和卵细胞的单倍体培养， 诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，建立单倍 体的基因转化受体系统；②直接利用花粉和 卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管通 道法，花粉粒浸泡法和子房微注射法
注意问题
• 直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物 • 选材：从组织类型上讲，子叶、叶片、胚轴 和某些营养变态器官通常比较容易诱导；从 细胞状态上讲，薄壁细胞状态外植体较容易 诱导
原生质体再生系统
原生质体由于除去了细胞壁的屏障，能够 直接高效的摄取外源DNA或遗传物质，甚 至细胞核 适合于现在建立的所有转化方法
抗生素敏感性 • 为了便于转化子的筛选需要使用选择标记 基因（如抗生素抗性基因等） • 选择性抗生素需满足的条件：①植物受体 材料对所选用的抗生素具有一定的敏感性； ②抗生素对受体植物没有剧烈的毒性，不 会很快杀死植物细胞 • 对抗生素过度敏感或过度钝化的植物材料 都不适合于构建植物转基因的受体系统
二、农杆菌敏感性试验
农杆菌介导的基因转化是目前植物基因转化 中使用较广、技术较成熟的实验体系 选择农杆菌敏感性较高的受体植物及其适宜 的组织细胞类型是成功转化的重要因素 • 转化前可用野生型农杆菌进行侵染试验，筛 选敏感性材料
第四节 受体系统常见的问题及其解决途径
再生能力及其遗传稳定性 愈伤组织褐化 再生植株玻璃化 影响受体系统转化效率的因素
特点
• 原生质体受体系统利于准确的转化和鉴定 • 转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少 • 但由于目前许多植物的原生质培养体系还不 成熟，受原生质体培养技术的限制，转化试 验的重复性较差 • 原生质体培养周期长，受体细胞本身的体细 胞变异频率高，遗传稳定性差
细胞系及其体细胞胚受体系统
经过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细 胞系，具有较好的遗传和生理一致性，经 过培养基调节，可形成体细胞胚 培养技术相对于原生质体培养来说要容易 得多，转化效率又优于其它组织培养系统 被认为是最为理想的基因转化受体系统
• 由于众多类型的植物离体培养技术的完善， 使转基因受体系统有了很大的选择范围 • 不同的受体类型具有不同的特点，适合的转 化方法也不同 • 实际操作中应根据受体的特性，基因转化方 法，选择适宜的受体系统
经过愈伤组织的受体系统
经过愈伤组织的受体系统是指外植体经脱分 化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得 再生植株的受体系统 包括 • 外植体先诱导形成愈伤组织，再利用愈伤组 织转化外源基因，进而再生植株 • 利用农杆菌直接侵染外植体，经过培养形成 愈伤组织，再分化成植株
• 建立一个好的受体系统是实现基因转化的先 决条件 • 受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技 术，而且要求比一般的组织培养技术要高
一、 高频再生系统的建立
高频再生系统必须满足4个条件： • 外植体的组织细胞具有诱导愈伤组织和再生 完整植株的能力，并且最好是外植体能直接 分化出芽 • 芽的分化率要高 • 易于离体培养，具有高度可重复性 • 体细胞无性系变异小
特点
• 具有更强的接受外源DNA的潜能 • 转化的基因无显隐性的影响，利于性状的选 育，加倍后可迅速获得纯合二倍体新品种 • 花粉管通道法将现代的分子育种与常规育种 紧密结合，是十分有潜力的受体系统 • 在花粉或小孢子培养技术成熟的植物种类中， 利用花粉或小孢子培养系统作为受体系统更 为理想
第三节 植物基因转化受体系统的建立
基因枪
• 1987年由美国康奈尔 大学Sonford等人设计 制造。 • 原理：将质粒DNA附 着在金属微粒上（金 粒或钨粒），然后借 助高压驱动，将附有 DNA的微粒射入靶细 胞内。
2.载体介导的基因转化
• 农杆菌介导的基因转化 • 病毒介导的基因转化
农杆菌介导的基因转化
3.种质系统介导的基因转化
外植体的选择
• • • • 外植体的生理年龄 外植体细胞的生理状态 外植体的遗传背景 外植体的选择与受体系统类型匹配
培养基的选择
• 植物的营养特性 • 选择原则 • 激素的选择
二、抗生素敏感性
受体系统建立时，需要对相关的抗生素种类 及其浓度进行试验筛选（抗生素敏感性试验） 抑制农杆菌生长的抗生素种类和浓度的筛选 要考虑植物种类和农杆菌株系两个方面 • 对植物细胞无毒，不显著抑制植物细胞生长 • 浓度以能够抑制农杆菌生长而不妨碍植物生 长的浓度为宜 用于转化子筛选的抗生素浓度的确定
• 花粉管通道法（PTP） • 生殖细胞浸泡法 • 胚囊、子房注射法
不同转化方法获得的转基因植株例数
第17章 植物基因转化受体系统
植物基因转化受体的条件 植物基因转化受体的类型及其特性
植物基因转化受体系统的建立 受体系统常见的问题及其解决途径
第一节 植物基因转化受体的条件
• 植物基因转化的受体系统：一般是指通过 组织培养途径或其它非组织培养途径，能 够高效、稳定地再生无性系，并能接受外 源基因的整合，对用于转化选择的抗生素 敏感的再生系统 • 附：植物转基因技术的主要方法
不经过愈伤组织的受体系统
不经过愈伤组织的受体系统也称为直接分 化再生系统，是指外植体细胞越过脱分化 阶段，直接分化出不定芽，从而获得再生 植株的受体系统 研究显示，采用叶片、幼茎、子叶、胚轴 以及一些营养变态器官为外植体时，在适 宜的培养技术控制下，均可直接分化出芽
特点
• 获得再生植株周期短，操作简单 • 体细胞无性系变异相对较小，可较好的维持 受体植株的遗传特性 • 转化的外源基因能稳定遗传（特别是茎尖） • 同样可能出现较多的嵌合体 • 外植体直接分化出芽较难，转化细胞直接分 化成植株难度更大
高效稳定的再生能力 • 具有较高的再生频率 • 具有良好的实验稳定性和重复性 较高的遗传稳定性 • 植物受体系统接受外源基因后不影响自身 非改造遗传体系 • 又能将外源基因遗传给后代，保持其遗传 的稳定性 • 同时选材时注意尽量减小受体系统体细胞 变异的发生
具有稳定的外植体来源 • 由于基因转化频率低，实验重复较多，因 此需要稳定的外植体来源 • 常用转化外植体：种子，无菌实生苗的胚 轴、子叶或幼叶，一些植物的试管苗，以 及可较高频率诱导的营养变态器官
农杆菌敏感性 • 农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率 高、多为单拷贝插入等优点，是常用的植 物基因转化方法 • 使用农杆菌介导的转化方法，需要植物受 体对农杆菌敏感 • 在选择农杆菌转化系统前，必须测试受体 系统对农杆菌的敏感性
根瘤农杆菌 及其诱导产生的冠瘿瘤
第二节 植物基因转化受体的类型及其特性
特点
• • • • 外植体来源广泛 扩繁量大，可获得较多的转化植株 适用的植物范围广 从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特 点，形成嵌合体较多 • 再生植物无性系变异较大，转化的外源基 因遗传稳定性较差
注意问题
• 直接使用外植体组织进行农杆菌侵染时， 应注意从活跃生长的植物部位取材 • 用愈伤组织进行转化，应在愈伤组织细胞 处于分生细胞状态时进行转化，此时易于 接受外源基因，转化效率高 • 愈伤组织必须保持良好的生长状态，继代 周期不能太长
• • • • • • 农杆菌菌株 Vir基因活化的诱导 外植体的类型和生理状态 外植体的预培养 外植体的接种及共培养 转化细胞的选择培养和转化植株再生
1.以原生质体或细胞为受体的直接基因转移 2.载体介导的基因转化 3.种质系统介导的基因转化
1.以原生质体或细胞为受体的直接基因转移
• • • • • • • 聚乙二醇法(Polyethyleneglycol，PEG) 电激法(Electroporatio，Ep) 脂质体法(Liposome，Lip) 磷酸钙－DNA共沉淀法(Ca-P) 显微注射法（Microinjection，Mi） 基因枪法（Particale bombardment, PB；Particale gun） 超声波法（Uls）