亚硫酸钠预处理提高稻草酶水解糖化效率的研究

亚硫酸钠预处理提高稻草酶水解糖化效率的研究曹杰;张帅;杨林峰;王旺霞;吴文娟;金永灿【摘要】The effects of sodium sulfite （Na2SO3） pretreatment on chemical composision and enzymatic hydrolysis of rice straw were investigated. Raising the temperature or increasing the charge of sodium sulfite can improve the dissolution of lignin and saccharification efficiency, while most carbohydrate is retained. However, when the dissolution of lignin attained 40%, the improvement of saccharification efficiency was nonsignificant. After enzymatic hydrolysis, total sugar conversion rate of 74.9% and total sugar yield rate of 43.5% can be achieved by using the substrate pretreated under the condition of temperature 140~C, sodium sulfite charge 16% and cellulase amount 20 FPU/g （cellulose）.%研究了亚硫酸钠预处理对稻草化学组分变化及酶水解性能的影响。

结果表明,提高温度或增加Na2SO3用量可以脱除更多的木质素和半纤维素,酶水解效率也相应提高,但木质素脱除率达到50%以后,继续增强预处理条件,对酶水解糖得率无显著的促进作用。

相比而言,加大Na2SO3用量更有利于使木质素溶出,提高温度更有利于使高聚糖溶出,加大Na2SO3用量比提高温度对酶水解效率的提高影响更显著。

通过实验得到亚硫酸钠预处理稻草的最优条件,在温度为140℃,Na2SO3用量为16%,纤维素酶用量为20 FPU/g（对纤维素）时,总糖转化率达到最大,为74.9%,此时的总糖得率为43.5%。

【期刊名称】《纤维素科学与技术》【年(卷),期】2012(020)002【总页数】10页(P1-10)【关键词】稻草;Na2SO3预处理;化学成分;酶水解;糖转化率【作者】曹杰;张帅;杨林峰;王旺霞;吴文娟;金永灿【作者单位】南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室,江苏南京210037;南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室,江苏南京210037【正文语种】中文【中图分类】TQ352.62木质纤维素主要由纤维素、半纤维和木质素组成，以纤维素为主体，半纤维素和木质素交织在其中，形成一个稳定的复合体。

在木质纤维素生产生物乙醇的过程中，必须首先对木质纤维素进行预处理，破坏其原有的稳定结构，使纤维素酶可以进入木质纤维素与高聚糖充分接触[1]。

许多文献报道了运用不同的方法对木质纤维素进行预处理，并且取得了一定的进展[2-6]。

化学预处理因为其操作简单，工艺完善，并且可以很好地部分破坏木质纤维素的结构，得到广泛重视。

生产生物乙醇原料的化学预处理与化学法制浆有很多相似之处，几乎所有的化学预处理均采用化学制浆的原理。

亚硫酸盐蒸煮是常用的制浆方法，包括酸性亚硫酸盐法、亚硫酸氢盐法、中性亚硫酸盐法和碱性亚硫酸盐法，也可用来对生物质进行预处理。

如Zhu 等[7-10]用酸性亚硫酸盐对木质纤维素进行预处理，通过部分破坏木质纤维素的结构来消除纤维素酶水解木质纤维素的阻抗作用，从而提高酶水解糖化效率。

我国是水稻种植大国，每年约产生2亿吨稻草，其中大部分直接丢弃在稻田里或焚烧处理，不仅污染环境，同时也是资源的极大浪费[11]。

如果能将稻草作为一种生物质原料生产燃料乙醇，将产生极大的经济效益，并解决中国能源危机的问题。

稻草含有大量的灰分且木质素含量较木材低，因此稻草结构相对于木材非常疏松，中性亚硫酸盐预处理即可达到破坏稻草结构的目的。

用中性亚硫酸盐预处理木质纤维素有以下优点：1）中性亚硫酸盐相对于其他酸碱预处理条件更为缓和，对碳水化合物的降解较少；2）中性亚硫酸盐预处理对木质素具有较好的磺化作用，可增强木质素的亲水性使其部分溶出；3）未溶出的木质素也有相当程度的磺化，即酶水解底物具有较好的亲水性，在一定程度上有利于提高酶水解效率；4）相对于酸性亚硫酸盐预处理，中性亚硫酸盐法初始预处理液的pH值为10～12，终了废液的pH值接近中性，稍加调节即可达到7以上，对设备的腐蚀较小。

本文结合制浆造纸中对木质纤维素的脱木质素方法，用中性亚硫酸盐预处理稻草，研究了预处理后稻草化学组分变化及对后续酶水解效率的影响。

1 材料与方法1.1 材料实验用稻草原料取自苏北，由江苏某造纸厂提供。

稻草风干后去根，切断至长度为3～5 cm，充分混合均匀后置于密封塑料袋中平衡水分。

酶水解用纤维素酶（NS 50013，酶活 84 fPU/mL）、木聚糖酶（NS 50014，酶活 850 fXU/mL）、β-纤维二糖酶（NS 50010，酶活350 CBU/mL）由Novozymes提供，酶活按文献[12]提供的方法测定。

用醋酸―醋酸钠缓冲液（pH 4.8）将纤维素酶、木聚糖酶和β-纤维二糖酶以酶活比为1 fPU∶1.2 fXU∶1 CBU 配成混合酶液，其中β-纤维二糖酶适当过量，以防止酶水解过程中纤维二糖的积累[13]。

1.2 Na2SO3预处理Na2SO3预处理在自制10×1 L电加热油浴锅中进行，每罐装入相当于绝干质量80 g的稻草原料，相对于绝干原料的Na2SO3用量分别为0、4%、8%、12%、16%和20%，固液比为1∶6（w/v，g/mL）。

在80℃下空转预浸30 min后，以2℃/min 的速率分别升温至设定温度，保温1 h。

经Na2SO3预处理的稻草用水充分洗净，以除去残余化学药品和稻草的降解产物，离心脱水后置于密封袋中平衡水分24 h以上，通过测定其质量和水分，计算预处理浆料得率。

将预处理稻草用双圆盘磨浆机（KRK，磨盘直径300 mm，转速3 000 r/min）疏解成浆料，离心脱水后，一部分浆料风干用于化学成分分析，余下的撕碎后平衡水分用于酶水解试验。

1.3 酶水解精确称取相当于1 g葡聚糖的预处理浆料于150 mL锥形瓶中，以每克葡聚糖（纤维素）为基准，混合酶液用量以纤维素酶酶活计，分别为10 fPU/g和20 fPU/g，用pH 4.8的醋酸―醋酸钠缓冲液调节酶水解底物质量分数为5%。

在酶水解体系中加入0.3%（m/V）的叠氮化钠作为抗生素，以抑制水解过程中微生物的生长。

将锥形瓶置于大型恒温培养振荡器（DHZ-2102）中，在180 r/min，50℃条件下振荡处理48 h。

酶水解结束后将酶水解液和残渣混合物转移至离心管中，在5 000 r/min下离心10 min，分离酶水解液和残渣。

1.4 分析与检测1.4.1 苯―醇提取物、灰分和木质素分析稻草原料及预处理后浆料的苯―醇提取物和灰分含量根据文献[14]分析。

木质素含量根据美国能源部的方法[15]分析。

同时测定木质素中的灰分含量，计算Klason木质素含量时扣除灰分的含量。

以4% H2SO4为参比，用TU-1810紫外―可见分光光度计测定水解液在波长为205 nm处的吸光度，计算酸溶木质素的含量[15]。

1.4.2 原料、预处理浆料和酶水解液中糖含量分析移取1 mL原料或预处理后浆料4% H2SO4的酸水解液，加入40 µL 50%的NaOH调节水解液的pH值以满足仪器的进样pH值范围1～3。

混合均匀后用0.22 µm尼龙滤器过滤，取适量滤液至1.5 mL样品瓶待进样。

将酶水解液置于沸水浴中5 min使酶蛋白沉淀，离心后分离清液。

取1 mL清液稀释10倍后，用0.22 µm尼龙滤器过滤至1.5 mL进样瓶待进样。

原料、预处理后浆料酸水解液和酶水解液均采用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1200）分析单糖量，分析柱为Bio Rad Aminex HPX-87H 20n，300 mm×7.8 mm，保护柱为Cation-H Refill Cartridges，30 mm×4.6 mm，进样量为10 μL，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为 0.6 mL/min，柱温55℃。

检测器为RID示差检测器，外标法测定。

文中所有单糖均转化为聚糖。

2 结果与讨论2.1 稻草原料的主要化学成分实验用稻草的主要化学成分如表1所示。

稻草的化学成分与木材有显著的差异，主要表现在以下几个方面：1）稻草的半纤维素主要是由阿拉伯糖基-4-O-甲基-葡糖糖醛酸基-木聚糖组成，几乎不含葡甘聚糖。

针叶材松木和阔叶材硬枫木[16]的木聚糖含量分别是 8.8%和16.8%（质量分数，以下同），葡甘聚糖分别是11.7和2.9%，而本研究所采用稻草的木聚糖为 19.0%，没有检测到甘露糖。

2）稻草的总木质素含量仅为 17.0%，远远低于正常的针叶材和阔叶材，如松木和硬枫木的总木质素分别是 29.4%和 25.0%。

3）稻草的灰分含量特别高，而木材的灰分含量非常少，如松木和硬枫木的灰分含量分别是0.4%和1.5%。

与其它禾草类原料相比，稻草的总糖和木质素含量相对较低，而灰分含量偏高。

如Wiselogel等[16]报道麦草的葡聚糖含量38.2%，木聚糖含量21.2%，总木质素含量23.4%，均高于稻草，而灰分含量为10.3%，低于稻草中灰分的含量。

表1 稻草原料的主要化学成分分析（w/ %）∗总糖为葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖之和木质素高聚糖苯醇抽提物 Klason 酸溶总木质素葡聚糖木聚糖阿拉伯聚糖总糖* 灰分灰分中SiO2 2.8 13.6 3.3 17.0 35.9 19.0 3.1 58.1 14.3 9.1由于在微生物发酵生产乙醇的代谢途径中，五碳糖的代谢主要是通过磷酸戊糖途径并与ED（Entner-Doudoroff）途径相偶联，六碳糖的代谢主要通过糖酵解途径完成，五碳糖复杂的代谢途径使目前五碳糖发酵产乙醇相对困难[17]，稻草木聚糖含量高，在乙醇生产中需要更多的关注五碳糖的发酵。