OECD测试准则蚯蚓繁殖试验
三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应
三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应苏连水;杨桂玲;吴声敢;皮天星;王强【摘要】近年来农药复配使用成为普遍现象,它对生态的危害是否有别于农药单独使用？采用OECD人工土壤法,通过急性毒性、回避行为及抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性3个生态响应水平,研究三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应。
结果表明：三唑磷对蚯蚓7 d和14 d的半数致死浓度(LC50)分别为331.1 mg•kg￣1和122.0 mg•kg￣1；氯氟氰菊酯对蚯蚓7 d LC50和14 d LC50分别为897.9 mg•kg￣1和656.7 mg•kg￣1。
2种农药按毒性比1：1复配,表现为协同作用。
三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓48 h的半数回避浓度(AC50)分别是41.6 mg•kg￣1和6.0 mg•kg￣1,两者亦表现为协同作用。
经2种农药单独处理,蚯蚓体内CAT活性呈现轻微上升后下降,而POD和SOD活性无明显变化；复配导致POD活力显著上升,而CAT和SOD活力则显著下降。
研究表明：三唑磷和氯氟氰菊酯复配呈现协同作用,增强彼此对蚯蚓的毒性作用,增大土壤生态危害风险；联合效应的产生与其阻断神经传导这一共同靶标有关。
%The usage of pesticide mixture has been a common method for agriculture which may have many differ￣ences with the single use of pesticide. The joint toxicity effect of tiazophos and cyhalothrin to earthworm were studied using OECD artificial soil method. Acute toxicity, adviodance behavior and antioxidant enzyme activities (CAT, POD, SOD ) were observed. The result indicated that 7 d￣LC50 and 14 d￣LC50 of tiazophos are 331.1 mg•kg￣1 and 122.0 mg•kg￣1 in acute toxicity test;7 d￣LC50 and 14 d￣LC50 of cyhalothrin are 897.9 mg•kg￣1 and 656.7 mg•kg￣1 . The mixture with the ratio of 1:1 of toxic unit showed synergistic effect. The medium concentration for a￣voidancebehavior (AC50 ) of tiazophos is 41.6 mg•kg￣1 and of cyhalothrin is 6.0 mg•kg￣1 in adviodance behavior experiment. The mixture showed synergistic effect. Enzyme activities test indicated that CAT activity rose after de￣creased when Eisenia foetida was exposed to two pesticide singly. The POD activity increased in the joint expo￣sure. The CAT and SOD activities decreased in the joint exposure. It is concluded that joint exposure can strengthen toxicity to E. foetida. Joint toxicity effect of tiazophos and cyhalothrin is related to blocking the nerve transduction.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2016(011)003【总页数】8页(P294-301)【关键词】三唑磷;氯氟氰菊酯;次子爱胜蚓;急性毒性;联合毒性;抗氧化酶活性【作者】苏连水;杨桂玲;吴声敢;皮天星;王强【作者单位】南京农业大学植物保护学院农药系，南京210095; 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021;浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，杭州310021【正文语种】中文【中图分类】X171.5苏连水,杨桂玲,吴声敢,等.三唑磷和氯氟氰菊酯对蚯蚓的联合毒性效应[J].生态毒理学报，2016,11(3):294-301Su L S,Yang G L,Wu S G,et al.The single and joint toxicity of tiazophos and cyhalothrin to earthworm[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11 (3):294-301(in Chinese)农药混合污染联合效应广泛存在，传统意义只关注单一毒性效应而忽视联合毒性效应的评价，低估了污染物危害风险和潜在威胁。
蚯蚓生态毒理试验在土壤污染风险评价中的应用_颜增光
蚯蚓生态毒理试验在土壤污染风险评价中的应用颜增光1,何巧力1,2,李发生1*1.中国环境科学研究院土壤污染与控制研究室,北京 1000122.哈尔滨工业大学市政环境工程学院,黑龙江哈尔滨 150090摘要:蚯蚓是评价土壤环境质量的重要指示生物.近年来,蚯蚓生态毒理学取得了快速的发展,诞生了许多新的毒理测试技术和评价方法.概述了当前广泛采用的蚯蚓毒理试验方法,重点介绍毒性试验、种群动态调查、回避试验、生物富集试验、生物标志物试验的原理与特征,论述了各种试验方法在土壤污染环境监测和生态风险评价中的应用,并探讨了蚯蚓生态毒理学未来的发展与应用前景.关键词:蚯蚓;生态毒理学;生态风险评价;土壤污染中图分类号:X53;X17115 文献标识码:A 文章编号:1001-6929(2007)01-0134-09The Use of Earthworm Ecotoxicolo gical Test in Risk Assessmen t of Soil Con taminationYAN Zeng -guang 1,HE Qiao-li 1,2,LI Fa -sheng11.Depart ment of Soil Pollution Control,Chinese Research Academy of Environmental Sciences,Beijing 100012,China2.School of Municipal and Environmental Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,ChinaA bstract :Earthworm is one of the most important biological indicators of soil qualit y.Earthworm ecotoxicology has made rapid progress in the past years,and a number of test methods and approaches have been developed.The authors provided an overview of establis hed or standardized earth worm tests,including toxicity test,survey of population dynamics,avoidance test,bioaccu mulation test and biomarker test,and gave a brief introduction to their application in monitoring and risk assessment of soil contamination.Moreover,the prospect and future development of earth worm ecotoxicology were discussed.Key words :earthworm;ecotoxicology;ecological risk assessment;soil contamination收稿日期:2006-11-08基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)项目(2004CB418501);国家社会公益性专项(2005DIB3J161)作者简介:颜增光(1972-),男,广西横县人,博士后.*责任作者土壤污染是一个世界性的环境问题.土壤的污染程度和污染效应需要通过环境调查和监测来进行评价,其中生态风险评价是评估和表征污染物生物效应的一种常见方法,用于试验的生物包括动物、植物和微生物,蚯蚓便是其中的标准化测试物种之一.蚯蚓属环节动物门寡毛纲(Oligochaeta),是土壤中生物量最大的无脊椎动物,其在地球物质循环和陆地生态系统食物链物质传递中担负着重要功能,是最易受到环境有毒有害物质伤害的土壤生物之一,因而也是开展土壤污染生态风险评价的重要指示生物[1].蚯蚓毒理试验已广泛应用于对土壤生态环境进行监测和评价,尤其在污染土壤环境风险分级、污染物土壤质量标准与基准的制定、特定污染场地环境风险评价、污染场地修复效果评价等方面有重要的应用价值.近年来,蚯蚓生物标志物作为对污染物低剂量暴露效应的早期检测方法也得到了快速的发展,蚯蚓溶酶体、胁迫蛋白、金属硫蛋白、靶标酶、代谢和解毒酶等已成为检测土壤污染的常规生物标志物,单细胞凝胶电泳(彗星电泳)和DNA 加合物分析也已被广泛用于检测土壤污染物潜在的致癌、致畸、致突变效应.为适应蚯蚓生态毒理研究的快速发展,国际上已于1991,1997和2001年分别在英国的谢菲第20卷 第1期环 境 科 学 研 究Research of Environmental SciencesVol.20,No.1,2007DOI ：10.13198/j.res.2007.01.136.yanzg.026尔德、荷兰的阿姆斯特丹和丹麦的奥尔胡斯召开了3次专题学术会议,讨论与交流蚯蚓生态毒理学的研究进展与发展.笔者主要概述蚯蚓生态毒理试验在土壤污染风险评价中的应用,从种群、个体、细胞、生化和分子等多层次、多水平上探讨蚯蚓毒理试验和生物标志物在土壤污染监测、土壤修复效果评价和土壤生态功能诊断上的应用前景和发展方向.1蚯蚓毒性试验在土壤污染监测与修复效果评价中的应用用于土壤生态毒理试验的蚯蚓主要来自后孔寡毛目的正蚓科(Lumbricidae),巨蚓科(Megascolecidae)和真蚓科(E udrilidae),常见的有赤子爱胜蚓(Eisenia fetida),安德爱胜蚓(Eisenia andrei),维尼斯爱胜蚓(Eisenia veneta),红正蚓(Lumbricus rubellus),陆正蚓(Lum bricus terrestris),背暗异唇蚓(Allolobophora caliginosa),Allolobophora chlorotica,Allolobophora tuberculata,Octolasium cyaneum,红丛林蚓(Dendrobaena rubidus),Eudrilus eugeniae,Perionyx ex cavatus,Pheretima posthuma,Octochaetus pattoni,长流蚓(Aporrectodea longa),背暗流蚓(Aporrectodea caliginosa)等10多种.这些蚯蚓是欧洲、北美、非洲、南亚次大陆和亚洲的广布种或本地种,其中最常用的是生活于腐殖质或富含有机质环境中的赤子爱胜蚓(E.fetida)和安德爱胜蚓(E.andrei).国际上已有多种用于开展蚯蚓毒性试验的标准化测试方法,如经济合作与发展组织(OE CD)修订和颁布的试验室测定化学物质对蚯蚓毒性的指导性文件[2)3],国际标准化组织(I SO)制定和颁布的一系列测定蚯蚓急性毒性、亚急性毒性、发育毒性、生殖毒性、回避行为试验、蚯蚓种群野外调查等标准化的试验方法[4)8].其他国家或地区也有自行制定的测试标准,如美国测试与材料学会(ASTM)的/试验室利用蚯蚓开展土壤毒性测试指南0[9],欧洲经济共同体(EE C)的/利用人工土壤测试蚯蚓的毒性0[10].目前,这些方法已被广泛应用于对有毒有害危险性物质的毒性监测和对污染土壤的生态风险评价.蚯蚓急性(致死)毒性和亚急性(亚致死)毒性试验是开发最早、技术最成熟的蚯蚓生态毒理试验.急性毒性试验以蚯蚓14d(或7d)的死亡率为测试终点,用引起蚯蚓半数死亡的致死中浓度(LC50)来表征污染物的毒性;亚急性毒性试验多以蚯蚓的体重(生物量)变化、繁殖量(产茧量)、茧孵化率和幼蚓存活率等作为测试终点,常用引起50%效应的有效中浓度(E C50)来表征污染物的毒性效应,也有用最低可见效应浓度(LOE C)或无可见效应浓度(NOE C)来表征污染物毒性的.这2种毒性试验因具有能够直接反映土壤的污染状况,所需测试设备相对简单,易于操作,耗费较低,有国际标准支撑,有质控程序控制系统的变异性,测试结果具有直接的生态相关性等优点,在土壤污染监测与毒性评价上得到了广泛应用,如对土壤中石油烃污染[11)12]、多环芳烃污染[13]、重金属的单一或复合污染[14)15]、农药污染[16]、爆炸物TNT污染等的监测[17].同时,蚯蚓急性和亚急性毒性试验也普遍用于对污染土壤修复效果进行评价,包括被重金属[18]、石油烃和多环芳烃[19]、农药[20]、爆炸物TNT等物质污染的土壤[21].此外,蚯蚓毒性试验还可用于对污染土壤的潜在生态风险进行归类和分级,也可为土壤质量基准与标准的制定提供基础毒理数据,如美国能源部橡树岭基地根据蚯蚓毒理数据构建了化合物的筛查基准[22],这为土壤污染化学监测与蚯蚓毒性评价的结合应用提供了有力的工具.2蚯蚓群落结构和种群密度对污染土壤生态功能的指示蚯蚓的种群密度调查和群落结构分析也可用于对污染土壤的生态功能进行动态指示,考察的终点包括群落的结构与组成、物种的多样性与丰度、种群的生物量、成P幼蚓比率等.目前已有多种用于蚯蚓野外调查的采样技术与方法,除传统的手拣法外,国际标准化组织还推荐了福尔马林、芥子毒气和电击提取等方法[6,8].利用蚯蚓种群调查评价土壤污染状况的应用实例还相对较少[23)26],用于污染土壤修复效果评价的也不多[27],原因可能是种群水平上的室内模拟试验(如微宇宙试验)或野外调查成本相对较高.由于土壤的异质性和蚯蚓固有的群集习性,使得野外调查或室内模拟试验均需要较大的样本量或重复数,并要求参加野外调查的人员有较高的动物分类学专业知识.目前,蚯蚓微宇宙试验还处于初步研究阶段,大多只局限于对化合物的毒性进行评价,还很少用于对野外污染土壤进行评价.然而,微宇宙试验提供的信息对于暴露评价可能更为真实,并且是可以测试间接毒性的少数几种测试技术之一.利用蚯蚓种群密度评价土壤污染的长期效应较为复杂,其结果受到多种生物和非生物因素的影响,波动性很大,不但个体的死亡可以引起种群密度的降低,蚯蚓达到生殖成熟所需要的时间、繁殖率、个135第1期颜增光等:蚯蚓生态毒理试验在土壤污染风险评价中的应用体的迁移率等都可以影响到特定场地中蚯蚓的种群密度大小[28].污染物对蚯蚓某一生理参数的影响也可能会通过其他参数的变化来发生补偿,如没有死亡的蚯蚓可能会通过增加后代的繁殖量(即增加种群的内禀增长率)来补偿和维持种群的密度.利用年龄结构模型预测蚯蚓的种群动态可能是一种较好的解决方法[29],但是这样的模型仍然需要通过野外调查来确认和优化参数方能奏效.在复杂的生态系统中,有时仅凭形态分类鉴定来描述污染物引起的蚯蚓种群多样性变化或丰度变异还是不够的,若能利用遗传多样性分析来表述种群结构的变化可能更为精确[30].由此可见,要在种群水平上实现对污染土壤的监测与评价,还需要探索和积累更多有关布点策略、采样技术、鉴定方法、监测周期等基本知识,在弄清蚯蚓的物种分布特征、生活史和生活习性、发生世代、繁殖规律、响应机理等的基础上,通过构建合理的评价模型,不断验证和优化评价参数,才能最终实现在种群水平上对特定污染场地进行准确的监测与评价.3蚯蚓回避试验及其在污染土壤生态功能评价中的应用国际标准化组织最近公布了利用蚯蚓回避试验检验土壤质量和化合物对蚯蚓行为效应的测试方法[7],该方法以蚯蚓48h的行为选择反应作为测试终点,评价土壤的栖息功能和蚯蚓对污染物的行为效应,推荐使用的参比化合物为硼酸(H3B O3),测试器具可根据试验需要选择二室或六室行为观测仪.事实上,自然界中的动物普遍利用化学信息来召唤同伴、寻求配偶、寻觅食物和寻找栖息地,同样地,动物也可通过化学信息感知不利的栖息环境或有毒有害物质,除非它们被高剂量毒物瞬时击倒或杀死,否则它们往往会对超出其忍受范围的不利条件和因素表现出回避反应.因此,从功能学的观点来看,动物的回避行为反应可以直接指示土壤质量功能的下降或已受到了限制,间接表明土壤可能已经受到污染或具有潜在的生态风险[31].已有研究证明,蚯蚓回避试验适用于检测土壤中的原油、矿物油、多环芳烃等石油类污染物,功夫菊酯、代森锰锌、本菌灵、多菌灵等农药,锰、锌、铜或其他重金属的混合物,以及TNT,KCl,NH4Cl,胺和乙二醇的混合物、冷凝剂等多种污染物[7],其敏感性高于急性毒性试验,也高于或至少等同于亚急性毒性试验中的生殖毒性试验[32)33],如蚯蚓回避试验对TNT污染土壤的响应质量浓度为29mg P kg[34],而急性毒性试验测定的LC50值为143mg P kg.蚯蚓回避试验已成功应用于对现实污染土壤的环境风险预测[24,35],其结果的稳定性优于跳虫的行为反应[36].此外,蚯蚓的其他行为反应,如爬行和移动、钻蛀和挖掘、取食和清除落叶等行为,也常用于对化合物的毒性和土壤污染进行评价,如在亚致死剂量(015和1mg P kg)吡虫啉(杀虫剂)污染的土壤中,2种蚯蚓Allolobophora icterica和Aporrectodea nocturna的钻蛀行为均有明显的变化[37].然而,由于蚯蚓爬行、钻蛀、取食等行为的复杂性,测试结果变异性大,评价参数(如钻蛀深度、钻蛀频率、钻蛀面积、摆动频率、所挖掘孔洞的形状和结构、取食次数和取食量等)也不易于进行统一定量和准确评价,因此在土壤污染评价中的使用还很有限,而回避行为试验由于成本低廉、易于观测与操作、试验周期短、反应灵敏度高、适于检测的污染物范围广、测试终点具有生态相关性等优点,加之有国际标准的支持,可以预见其在土壤生态功能评价中将是一种很有前途的测试工具[38],未来的工作倾向于筛选和鉴定出更多适于开展回避试验的蚯蚓种群和适于用该方法检测的污染物[39],以及对蚯蚓的化学感受特征和感受机理进行深入的研究.4蚯蚓对污染物的生物富集与污染土壤生态风险预测单纯依靠测定土壤中污染物的总浓度来评价土壤的环境质量并不科学[40].土壤、污染物和生物的相互作用是一个复杂的过程,污染物在土壤中的赋存形态,污染物与土壤的结合残留,生物体对污染物的暴露方式与途径,生物体自身的生理活动与代谢特点等,都可影响到污染物进入生物体的过程和在其中滞留的水平,这可以通过生物富集研究来测定和反映.生物富集(bioaccumulation)是指环境物质进入生物机体或组织,并引起累积、残留、富集等效应的过程.蚯蚓可从土壤中摄取多种有机和无机污染物,它是研究土壤污染物生物有效性的经典动物,其在评价不同形态的重金属生物可利用性上尤为多见[41)42].通过测定蚯蚓整体或特定组织中污染物的浓度,再与土壤中相应污染物的浓度进行比较,可以计算出污染物在蚯蚓体内的生物浓缩因子(BCF)或生物富集系数(BAF),从而确立污染物的生物有效性[43].利用浓缩因子或富集系数,可以对直接测定的土壤污染物浓度进行生物有效性换算和预测污染136环境科学研究第20卷土壤的潜在生态风险,或用于对污染土壤修复效果进行评价[44].目前,已有多种预测模型和仿生技术被开发用于生物富集研究[45)48],如半透性滤膜(SPMD),C18材料,固相微萃取(SPME)技术等,也有人提出利用/临界机体残留(CBR)0方法来评价土壤环境质量[49].美国测试与材料学会(ASTM)已公布了关于试验室开展蚯蚓生物富集试验的标准草案[50],经济合作与发展组织(OECD)也在制定类似的标准[51].除受污染物浓度的直接影响外,污染物的结构和性质[52]、土壤的性质(尤其是pH,有机质含量,阳离子交换力)、蚯蚓的种类和发育阶段[52)53]、生活习性[54)55]、栖居环境与暴露途径等[56],都对污染物的生物富集有很大的影响.尽管生物富集水平与土壤的污染状况有直接的关联,但由于存在物种间响应的差异和污染物提取技术上的多样化,加之生物的耐受能力、解毒能力、排泄速率等的差异,生物富集研究往往具有很大的变异性[57)58].此外,污染物在蚯蚓体内的浓度与其毒性并非总是直接相关,因此生物富集研究只有与毒性测定结合起来进行,才能更为有效地评价污染物的环境行为与生物效应[43],从而对污染土壤的生态风险做出准确的预测.5蚯蚓生物标志物用于土壤污染暴露的早期预警和风险评价近年来,生物标志物的研究得到了迅速的发展,并被强烈推荐用于对环境中污染物的暴露评价或生物效应的检测[59].然而,目前在生态毒理学领域对生物标志物的概念还颇有争议,还没有统一的或被普遍接受的定义,通常生物体在个体或者更为微观的水平上(如组织、细胞、分子)的生理、生化、分子或遗传反应都可视为生物标志物反应(biomarker response).生物标志物最大的优点是可以灵敏地检测到环境中低剂量的潜在污染物,并可通过多项反应指标提供有关环境毒性的综合信息.生物标志物可用作评价土壤污染的早期预警系统[60],部分生物标志物对特定化合物或化学基团还表现出特异的反应,如动物的乙酰胆碱酯酶受抑制往往意味着其对类胆碱功能的农药(如有机磷类、氨基甲酸酯类等)有暴露史,但有的生物标志物可能会对多种结构上并不相关的化合物都有响应,如生物体内广泛存在的多功能氧化酶(MFOs)对外源异生物质就具有普遍反应性.蚯蚓生物标志物是用于检测和评价土壤污染的常用手段之一,尤以溶酶体,金属硫蛋白,热休克蛋白,总免疫力,胆碱酯酶,多功能氧化酶,DNA 损伤等最为常用.蚯蚓体腔细胞溶酶体是应用最多、也是最成熟的蚯蚓生物标志物[61],可以通过判断溶酶体膜的稳定性(利用中性红染料保留时间来判断)来表征蚯蚓受到的污染胁迫.溶酶体是由高尔基体的囊泡发育而成的亚细胞结构(细胞器),内含多种水解和消化酶系,溶酶体可通过吞噬方式消化、溶解部分由于损伤而丧失功能的细胞器和其他细胞质颗粒或经细胞摄入的外源物质.蚯蚓体腔细胞内的溶酶体能很快地吸收、容留和积累中性红染料,当蚯蚓受到污染物的伤害时,其溶酶体膜会变得脆弱和容易发生泄漏,溶酶体摄取的中性红染料就会释放到细胞质中,将细胞染成红色,用溶酶体中性红保留时间(NRRT)即可反映污染物对蚯蚓的毒性效应[62].蚯蚓溶酶体膜稳定性试验已较多用于对重金属污染土壤的监测与评价中[14,23,63)65],对农药,石油烃,多环芳烃,TNT,奥克托金(H MX)等土壤污染物的评价也有报道[12,17,66)68].蚯蚓溶酶体对土壤污染的反应敏感性一般要高于毒性试验中的死亡率、体重变化、产茧量、茧孵化率、幼蚓生还率等测试终点,有时甚至高于免疫活力和酶活性检测[69],且可用于对污染场地进行原位监测[70)71],因而是一种应用潜力巨大的生物标志物[61],但其成本与效益的权衡,以及在预测个体健康状况上的相关性还有待于进一步探究.金属硫蛋白(metallothioneins)具有解毒和调节机体内微量元素平衡的双重功能,其可被多种金属所诱导,因而可作为检测金属污染的生物标志物,具有很强的特异性.蚯蚓金属硫蛋白的表达多采用免疫反应(抗原-抗体反应)进行检测,最近也有报道从基因转录等分子水平上检测金属硫蛋白的表达变化[72].目前,蚯蚓金属硫蛋白已成功应用于对镉、铜、锌等重金属暴露的评价[72)76],证明其适用于对土壤中重金属污染进行特异性诊断.与金属硫蛋白不同,热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)可为多种污染物所诱导,其中也包括重金属.热休克蛋白最初是在果蝇的唾液腺中作为一种对热反应的应激蛋白被发现的,后来的研究证明其对多种胁迫因素都有反应[77],因而也是检测土壤污染的生物标志物,最多采用的是Hsp70和Hsp60.蚯蚓热休克蛋白已用于氯乙酰胺,五氯酚,重金属铜、铅、锌、镉、汞等土壤污染物的暴露评价中[75,78],但由于热休克蛋白的应答缺乏特异性,且易于受到各种环境因子的影响,其137第1期颜增光等:蚯蚓生态毒理试验在土壤污染风险评价中的应用在土壤污染诊断上的应用还有待于进一步优化和改进.蚯蚓体内存在多种可受污染物抑制或对污染物的诱导有响应的酶系,包括调控基础代谢与生理活动的功能酶系、对外源物质具有降解作用的解毒或水解酶系,以及其他具有防御功能的酶系如抗氧化酶、溶菌酶等.由于这些酶系在生化水平上能对污染暴露做出敏锐的响应,因而也是检测土壤污染的有益标志物.蚯蚓的乙酰胆碱酯酶(AchE)是有机磷、氨基甲酸酯类农药作用的靶标,污染物的存在可明显抑制蚯蚓乙酰胆碱酯酶的活性,这对于检测农药在土壤中的残留与污染十分有效[79,26],并且是少数几种具有较强特异性的生物标志物之一,不过也有报道重金属(铅和铀)可以抑制蚯蚓的乙酰胆碱脂酶[80],但多环芳烃中的苯并[a]芘似乎对其活性没有影响[81].细胞色素P450酶系是生物体内多功能氧化酶的重要组成部分,在底物的诱导下可快速、大量地表达,催化外源化合物发生氧化降解和解毒,作为生物标志物在环境监测与预报上有重要的意义.蚯蚓P450酶系可用于对土壤中的有机污染物如多环芳烃等进行监测[82],具有敏锐响应和早期预警等功能,缺点是反应没有特异性,蚯蚓的发育阶段和生理状况以及环境因子对酶的活性影响也很大,蛋白的提取纯化技术和测定方法也相对复杂和繁琐,影响酶活性测定的准确性.蚯蚓体内的其他代谢酶如磷酸酯酶,B-半乳糖酶,纤维素酶,NADH和NADPH还原酶等也曾作为生物标志物用于对土壤污染物的监测与评价[16,81,83].污染物的胁迫也会损害或破坏生物体内的代谢平衡,引起代谢产物的积累和活性氧等有害物质的过量产生,生物体对此可启动防御系统如抗氧化酶系等来抵御和清除这些物质,因此抗氧化酶活性的变化可以间接反映环境中污染物的存在,是预测预报污染物生态风险的敏感生物标志物.目前,蚯蚓体内的过氧化氢酶(C AT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等已被证实可对多环芳烃、杀虫剂、除草剂、重金属等做出响应[66,74,79,81],预示着蚯蚓抗氧化酶系作为生物标志物具有广阔的应用前景.在种类繁多的生物标志物中,最能真实反映污染物生态风险和真正实现早期预警功能的是表征污染物遗传毒性或突变效应的生物标志物,这在人体健康风险评价中已得到了证实[84].利用蚯蚓细胞研究污染物遗传毒性的常用技术包括单细胞凝胶电泳(彗星电泳)和DNA加合物分析[85)87],二者均可灵敏表征多环芳烃、农药、重金属等污染物潜在的遗传毒性和早期暴露效应[66,87)89].因此,蚯蚓细胞DNA 损伤是检测污染物致癌、致畸、致突变效应的理想生物标志物[89],其在土壤污染遗传毒性分析和环境风险预测中有重要的应用价值.此外,蚯蚓的再生能力、发育历期[12]、伤口愈合[90]、组织病理变化、基因转录变化[91]、游离糖和氨基酸的组成与含量变化等都可用作评价土壤污染的生物标志物[92].好的生物标志物应该满足以下标准:能够反映污染物的剂量效应关系和时间效应关系,测试系统中的干扰因素已得到识别并可实施控制,测试方法简便、经济、可操作性强,测试终点具有生态相关性,测试结果灵敏、稳定、具有化学特异性和物种差异性,且为公众所接受和得到管理阶层的信任[61].然而,目前已大量构建的生物标志物还没有国际通用的标准检验检测方法[51],多数测试结果也没有在生态系统水平上得到确认和验证[51,61],今后还需要不断加强生物标志物反应与个体、种群、群落水平上的效应之间的相关性研究[93],从而使生物标志物研究能够直接外推用于对污染土壤进行风险预警和评价.6结语事实证明,单纯依靠化学分析并不足以全面反映土壤的真实污染状况[93],作为对化学检测方法的一项互补技术,毒理试验具有独到的优点和特点,如直接产生污染土壤对生物的毒性信息,真实反映土壤污染物对生物体多介质、多途径暴露的现实情况,全面提供复合污染的整体毒性效应,灵敏检测低含量的剧毒污染物,持续跟踪污染物的代谢毒性等.目前,蚯蚓毒理试验在污染土壤生态风险评价中的作用倍受瞩目[94],其既可用于对污染物进行前瞻性的毒性预测,也可用于对历史污染场地进行追溯性的风险评价,试验方法和试验技术正在不断走向国际化和标准化,测试终点和评价指标也在种群、个体、细胞、组织、生化、分子、遗传等多层次、多水平上不断得到深化和发展,生物标志物的研究不断得到加强,日益丰富的蚯蚓毒理数据将为污染物定量构效关系(QSAR)的确立和土壤污染环境监测与管理做出新的贡献.我国利用蚯蚓作为毒性测试模型也做了许多探索性的工作,测定了杀虫剂、除草剂、重金属等许多常见土壤污染物的毒性[95)97],并于近年开始从生理138环境科学研究第20卷。
作为土壤污染生物标志物的蚯蚓体腔细胞提取方法比较
第29卷第3期2011年6月上海交通大学学报(农业科学版)JOURNAL OF SH ANGH AI JIAOTONG U NIVERSIT Y (AGRICU LTU RAL SCIENCE)Vol.29No.3 Jun.2011文章编号:1671 9964(2011)03 0001 DO I:10.3969/J.ISSN.1671 9964.2011.03.001收稿日期:2010 12 23基金项目:国家自然科学基金项目(21047001);上海市自然科学基金项目(09ZR1426700);上海市技术标准专项(10DZ0503900)作者简介:朱 江(1974 ),男,博士,高级工程师,研究方向:环境毒理学,E m ail:zhuj@s 作为土壤污染生物标志物的蚯蚓体腔细胞提取方法比较朱 江1,杨道丽2,李志刚3,王振旗1,毛俊亚1(1.上海市环境科学研究院,上海200233; 2.上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240;3.山东丝绸纺织职业学院,山东淄博255300)摘 要:比较了纤维针法(FNE)、电压刺激法(EE)、超声波刺激法(U P)、纤维针与超声波刺激结合法(CM)四种蚯蚓体腔细胞提取方法。
结果表明:单位体重细胞数由大到小依次为CM >U P>EE>FNE,细胞的成活率由大到小依次为CM >FNE >EE>UP,其中CM 法提取的单位体重细胞数(106个)较多(4.638 0.138)且存活率(%)最高(97.258 0.161)。
CM 法所提取的体腔细胞能满足作为土壤污染风险评估生物标志物的要求,可以为在细胞水平、亚细胞水平和分子水平对污染土壤开展风险评估提供技术支持。
关键词:蚯蚓体腔细胞;纤维针与超声波刺激结合法;生物标志物;土壤污染中图分类号:X5 文献标识码:AComparison Studies on the Methodology of Extracting Coelom cytes in Earthworm Used as a Biomarker for the Evaluation of the Soil PollutionZH U J iang 1,YA N G D ao li 2,L I Zhi gang 3,WA N G Zhen qi 1,MA O J un y a1(1.Shanghai A cademy of Env ir onmental Sciences,Shang hai 200233,China;2.Scho ol o f Env ir onmental Science and Engineering ,Shanghai Jiao tong U niv ersity ,Shang hai 200240,China;3.Shando ng Silk T ex tile V ocatio nal College,Shandong Zibo 255300,China)Abstract:Four methods for extracting coelomcytes in earthworms (Eisenia f oetida )w ere developed including FNE (fiber needle ex traction),EE (electrical extraction),UP (ultrasound protocol)and CM (combined method of fiber needle extraction w ith ultrasound protocol).The effect of different methods on the efficiency of the extraction was compared based on the total counts of coelomcytes and viability of coelomcytes.The results showed that the ratio of coelomocyte counts to body weight from different methods w as listed in the following order:CM >UP >EE >FNE.The viability of coelomcytes (%)was presented in the order of CM>FNE >EE>UP.Among these methods,CM exibited the peak value of coelomocytes counts/body weight(4.638 0.138)as well as the viability of coelomcytes (%)(97.258 0.161),indicating satisfactory efficiency of the ex traction method.Thus,this extraction method could be used as a practical tool in the ex periments at cellular,sub cellular and molecular levels,and coelomcytes could be considered as a valuable and sensitive biomarker to evaluate the adverse effects of pollutant in soil environment.Key words:earthw orm co elo mcy tes;combined method of fiber needle ex traction w ith vltrasound protoco l (CM);biomarker;soil po llution上海交通大学学报(农业科学版)第29卷蚯蚓的外部屏障结构和内部免疫机制共同构成了蚯蚓的免疫防御体系,而蚯蚓的内部免疫机制主要包括细胞免疫和体液免疫。
观察蚯蚓再生实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景蚯蚓，作为土壤中重要的分解者，对生态系统的平衡起着至关重要的作用。
蚯蚓的再生能力是它们适应环境、繁衍生息的重要机制之一。
本研究旨在通过观察蚯蚓的再生现象，探讨蚯蚓再生能力的特点及其影响因素。
二、实验目的1. 观察蚯蚓的再生现象，了解蚯蚓再生能力的范围和特点。
2. 分析不同剪切部位、不同体节数对蚯蚓再生能力的影响。
3. 探讨影响蚯蚓再生能力的因素。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜蚯蚓（品种：大平2号）、剪刀、培养皿、土壤、湿度计、温度计等。
2. 实验仪器：显微镜、电子天平、量筒、秒表等。
四、实验方法1. 蚯蚓剪切：将新鲜蚯蚓用剪刀按照有头无尾、无头无尾、无头有尾三种不同的体节段进行剪切。
2. 培养条件：将剪切后的蚯蚓分别放入培养皿中，放入适量土壤，保持土壤湿度在60%左右，温度控制在23～24℃。
3. 观察记录：每天观察蚯蚓的再生情况，记录再生时间、再生长度、存活率等数据。
4. 数据分析：对实验数据进行统计分析，探讨不同剪切部位、不同体节数对蚯蚓再生能力的影响。
五、实验结果与分析1. 蚯蚓再生现象：观察发现，蚯蚓具有再生能力，剪切部位不同，再生能力存在差异。
头部再生能力最差，中间体段次之，尾部再生能力最强。
2. 不同剪切部位对蚯蚓再生能力的影响：从实验结果可以看出，蚯蚓头部再生能力最差，中间体段次之，尾部再生能力最强。
这可能是因为蚯蚓的再生能力与其组织结构、细胞分裂和生长速度等因素有关。
3. 不同体节数对蚯蚓再生能力的影响：观察发现，随着剪切后蚯蚓体节数的增加，蚯蚓的再生能力逐渐增强。
这可能是因为蚯蚓的再生能力与其体内营养物质、能量代谢等因素有关。
4. 影响蚯蚓再生能力的因素：影响蚯蚓再生能力的因素主要有以下几方面：（1）剪切部位：蚯蚓不同部位的再生能力存在差异，这与蚯蚓的组织结构、细胞分裂和生长速度等因素有关。
（2）体节数：随着体节数的增加，蚯蚓的再生能力逐渐增强，这与蚯蚓的体内营养物质、能量代谢等因素有关。
降解塑料的定义、分类、标识和降解性能要求-最新国标
降解塑料的定义、分类、标识和降解性能要求1 范围本标准规定了降解塑料的术语和定义、分类和标识、降解性能要求、试验方法。
本标准适用于以下各类降解材料：——天然和/或合成聚合物、共聚物或它们的混合物；——含有如增塑剂、颜料或其他化合物等添加剂的塑料材料；——水溶性聚合物；——各类降解塑料材料加工而成的制品。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 15337 原子吸收光谱分析法通则GB/T 19276.1-2003 水性培养液中材料最终需氧生物分解能力的测定——采用测定密闭呼吸计中需氧量的方法GB/T 19276.2-2003 水性培养液中材料最终需氧生物分解能力的测定——采用测定释放的二氧化碳的方法GB/T 19277.1 受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法GB/T 19277.2 受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第2部分: 用重量分析法测定实验室条件下二氧化碳的释放量GB/T 19811 在定义堆肥化条件下中试规模试验中塑料材料崩解程度的测定GB/T 22047 土壤中塑料材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定密闭呼吸计中需氧量或测定释放的二氧化碳的方法GB/T 32106 塑料在水性培养液中最终厌氧生物分解能力的测定通过测量生物气体产物的方法GB/T 38737 塑料受控污泥消化系统中材料最终厌氧生物分解率测定采用测量释放生物气体的方法GB/T 33797 塑料在高固体份堆肥条件下最终厌氧生物分解能力的测定采用分析测定释放生物气体的方法ISO 10253:2006 Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutumISO 11348-3:2007 Water quality —Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteriaISO 14669:1999 Water quality —Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea)ISO 16712:2005 Water quality — Determination of acute toxicity of marine or estuarine sediment to amphipodsISO 18830:2016 Plastics —Determination of aerobic biodegradation of non-floating plastic materials in a seawater/sandy sediment interface — Method by measuring the oxygen demand in closed respirometerISO 19679:2016 Plastics —Determination of aerobic biodegradation of non-floating plastic materials in a seawater/sediment interface — Method by analysis of evolved carbon dioxide ISO 22404:2019 Plastics — Determination of the aerobic biodegradation of non-floating materials exposed to marine sediment — Method by analysis of evolved carbon dioxide EN 13432:2000 Packaging - Requirements for packaging recoverable through composting and biodegradation - Test scheme and evaluation criteria for the final acceptance of packaging OECD 208 Seedling Emergence and Seedling Growth Test3 术语和定义本标准采用下列定义。
生物实验蚯蚓再生的试验报告
生物实验蚯蚓再生的试验报告编者按：查字典大学网为大家收集并发布了生物实验:蚯蚓再生的试验报告 ,供大家参考 ,希望对大家有所帮助!生物实验:蚯蚓再生的试验报告以下是关于蚯蚓再生的试验报告将蚯蚓按不同部位切断,得到有头无尾,无头无尾,无头有尾三种不同的体节段,在室温有土条件下培养,观察其再生现象.结果发现蚯蚓从头到尾都有再生能力,但不同体段,不同体节长度的蚯蚓再生能力不同.其中尾部的再生能力最强,再生速度最快,中间体段次之,头部的最差.还观察到按不同体节数剪切对蚯蚓的存活率有很大的影响,所剩体节数与存活率成正比关系.:"太平二号"蚯蚓;再生;存活率再生(regeneration)是生物个体或器官对非自然丧失部位的修补和复原,被认为是生物适应环境的最重要机制之一.人们很早就发现折断损伤后的蚯蚓具有再生恢复的能力.2019年,中国科学院动物研究所三位专家(齐莉萍,戈峰,周晓东)在?应用与环境生物学报?上发表?蚯蚓再生能力的研究?,并指出蚯蚓的再生能力与切割部位有关以及存活率与体节数正相关等观点,丰富了人们对蚯蚓再生能力的认识.近年来,随着细胞生物学,分子生物学和神经生物学的兴起和开展,为深入研究蚯蚓的再生机制提供了根底."大平2号"蚯蚓在以牛粪为饲料,温度23℃～24℃,相对温度为60%的条件下饲养,卵期为14～18天;幼蚓期为40～45天,从具有繁殖节到产卵为5～7天."大平2号"的繁殖能力非常强,适合于做长期的实验;切割后,一般不会出现坏死和死亡现象,为实验提供了保证.本实验通过对蚯蚓不同体节的切割和对不同体节数切割对存活率的影响,初步探讨了蚯蚓再生的机制和对环境的适应性.1材料与方法1.1 材料来源 "太平二号"于深圳市华强北鱼饵店购置,在直径9cm培养皿培养,以苹果皮为饲料.1.2 培养与观察解剖镜下"太平二号"的形态学观察:总体节数为85—110节,生殖环为三节,位于体节的前端,生殖环后约2/3体节数.按照不同要求切割蚯蚓后,放入直径9厘米的培养皿,在暗处培养,每天补充少量水分,隔日喂养苹果皮,并每天上下午各观察一次,记录蚯蚓的死亡数.观察蚯蚓的再生情况,并对再生现象明显的拍下照片.1.3 研究方法1.3.1 二段分组 (1)取5条蚯蚓,分别平分头尾2段;(2)取5条蚯蚓,分别在距离尾端四分之一体长的地方切成头尾2段;(3)取5条蚯蚓,以环带为界限,而后分切成头尾2段,使含头的那一段为无环带;(4)取5条蚯蚓,以环带为界限,而后分切成头尾2段,使含头的那一段为有环带(5) 取5条蚯蚓,分别平分头尾2段,不切断;(6) 把上面(1)-(4)所切成的蚯蚓片段,分别编号,放培养皿中饲养.1.3.2 三段分组 (1) 取5条蚯蚓,把其等分长三段;(2) 取5条蚯蚓,以环带为界限,将环带和头部作为一节,以距离尾端四分之一体长作为一节,中间为一节;(3) 取5条蚯蚓,以环带为界限,使含头的那一段为无环带,以距离尾端四分之一体长作为一节,中间包括环带的为一节;(4) 取5条蚯蚓,把其等分长三段,不切断;(5) 把上面(1)-(4)所切成的蚯蚓片段,分别编号,放培养皿中饲养.1.3.3 四段分组取5条蚯蚓,把其等分成四段,分别编号,放培养皿中饲养.1.3.4 五段分组取5条蚯蚓,把其等分成五段,分别编号,放培养皿中饲养.1.3.5 空白对照组取5条蚯蚓,编号,放培养皿中饲养.1.3.6 混和培养组取5条完好蚯蚓和5条二等分的蚯蚓,编号,放培养皿中饲养.2. 结果2.1 不同体节不同程度的再生情况结果说明不同切法所得的蚯蚓的不同体节都有不同程度的再生现象,其中尾部的再生能力最强,再生速度最快,中间体段次之,头部的最差.图1-1 1-2的再生情况; 图1-2,图1-4 1-3的再生情况; 图1-3 1-4的再生情况;图1-5 1-5的愈合情况; 图1-6 刚切割的蚯蚓对照图2.2不同体节的存活率对蚯蚓不同体节的13种切割的存活率分析(图2)说明,1-3,1-5的存活率最高,第4组的存活率最低,大体趋势为切割的段数越多,存活率就越低.但明显有一组例外(1-2),可能是外界环境如湿度造成的.由此可以得出结论:体节越多的存活率越高,有头无尾的比有无头有尾的再生能力强,无头无尾的存活率最低,再生能力也最弱.图2 不同切法的存活率图示2.3体节数和存活率的关系通过对蚯蚓存活率与其体节数的分析(图3),发现蚯蚓的存活率与其体节树正相关,即体节数越多,蚯蚓的存活率越高.图3 体节数和存活率的关系3讨论3.1实验的整体进展情况蚯蚓从切割开始,每天给少量水分补给,隔天喂食苹果皮,生活生长情况良好,从第7天开始出现再生,先是在伤口出现形成一个颜色浅淡的环节,然后环节变粗颜色边暗,与此同时,伤口愈合初长出嫩黄色的小牙,如图1和图四.以后小牙变长变粗,漫漫形成了原来剪切掉的部位.实验进行了二十天,到达了令人满意的效果.以前有很多师兄师姐做过类似的实验,但都失败了.当我们确定题名的时候,老师们严肃的告诉我们,这个实验不好做,以前很多人做都失败了.当时我们听了也疑心,但我们不放弃,诚恳请教了老师和师兄师姐,最后我们一致认为造成蚯蚓大量死亡而实验失败的可能原因是蚯蚓的培养过程.以前多是在无土培养条件实验的,很可能蚯蚓因不适应这种新环境而死亡.鉴于此,我们做有土培养,并定时补充水分,尽量保持蚯蚓原来的生态环境,果然,蚯蚓存活率大大上升.我们由此意识到,做实验要胆大心细,敢于创新,迎难而上.3.2不同切割蚯蚓的再生能力不同切割对蚯蚓的影响如图2所示,从中可以看出,切的段数越少,蚯蚓的存活率相对越高.实验中还观察到,切断尾部的再生能力最强,切掉头部的再生不如切掉尾部的明显,而切掉两段的再生不强,多表现为愈合.对此,我提出了疑问,再生强的尾部是不是该处储存的营养物质丰富还是尾部的细胞的分化程度低机体又是如何意识到缺失的部位并组织再生的这些问题,在实验中没找到答案,我查阅了相关资料,其说法不一,希望今后对实验进一部完善,最终揭开蚯蚓再生的神秘机制.3.3剪切后体节数和存活率的关系由图3可以看出,剪切后的蚯蚓的存活率随体节数增加呈上升趋势,即体节越短,死亡率越高,这可能和蚯蚓体节长其抗逆能力强及所储存的营养物质多有关,但剪切后蚯蚓体段是否有头或有尾与蚯蚓的存活率无关.。
208-陆生植物生长试验
和观察与未处理的对照进行比较。
3.
根据可能的暴露途径，供试品混入土壤（或可能的人工土壤基质）或喷洒
在土壤表面，尽可能正确代表化学品潜在的暴露途径。土壤混合时先进行大量散土
的混合，然后再装入盆中，将所选植物种类种子种入土壤中。表面施药时，先将土
壤装入盆中，将种子种好，然后再喷药。试验体（对照和处理土壤及种子）放在适
所选品种应种质均一，来源可靠，且供种方具有标准化生产能力，能够持续供 种。所供种子的萌芽，和幼苗生长一致可靠。
植物应适于在实验室进行试验，在实验室内及之间能够得出可靠和可再现的结 果。
所用种的敏感性应与暴露于供试品环境中发现的植物反应一致。
所选种已用于以往的一些毒性试验，它们在如除草剂生物测定、重金属筛选、
或生长测量来评价试验系统的性能，可以作为实验室内部质量控制测量。
试验方法的描述
自然土-人工物质
8.
可以用含 1.5%以上有机碳（大约 3%有机质）的砂壤土、壤质砂土或砂质粘
壤土装入花盆，种入植物。含 1.5%以上有机碳的商业盆栽土或合成混合土均可用。
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合植物生长的环境中。
4.
本试验可根据研究目的测定剂量-反应曲线，或单剂量/比率作为限度试验。
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OECD/OCDE
如果单剂量/比率试验超出一定的毒性水平（例如观察到的效应高于 X%），要进行 范围筛选试验测定毒性高和低限，再进行多剂量试验产生剂量-反应曲线。适当的统 计分析方法分析获得最敏感参数的作用浓度 Ecx 或有效施用率 Er（x 如 EC25，ER25， EC50，ER50）。同样无作用浓度（NOEC）和最低作用浓度（LOEC）也能计算出来。
实验3 污染物对土壤动物的毒性试验
[计算]
根据实验结果计算SDBS对蚯蚓的LC50 [讨论] 蚯蚓对土壤环境污染有何指示作用？蚯蚓毒性试验与小白鼠毒性试 验有何异同？
实验3
污染物对土壤动物的毒性试验
目的和意义
了解污染物对土壤生态的指示生物蚯蚓的毒性，理解蚯蚓对土壤环 境的污染指示作用，掌握蚯蚓毒性试验的常用方法。
实验动物与实验原理
蚯蚓实验室毒性试验常见的有：
1. 滤纸接触试验(Con tact f ilter paper test) (O ECD2gu idelin触法。 1)清肠：取一烧杯，在底部铺上一层滤纸，加少量水，以刚浸没滤纸为宜。 挑选具有环带的健壮蚯蚓，放在滤纸上，用塑料薄膜封口，并用解剖针扎孔 ，将烧杯放入温度为20º C±1º C，湿度约75％的人工气候箱中，清肠一天。 2) 配药：在直径15cm的培养皿底铺衬滤纸，以刚好遮住皿底为宜。按预备 实验确定的剂量将受试物溶于纯化水，配成系列浓度，取适量溶液倒入培养 皿中，以刚好湿润浸没滤纸为宜。 3)放入蚯蚓：将清肠后的蚯蚓冲洗干净，并用滤纸吸干蚯蚓体表的水分，放 入培养皿中。每一处理放入蚯蚓10条。用塑料薄膜封口，并用解剖针扎孔。 4)培养：将培养皿放入人工气候箱中培养，箱中为标准实验条件：温度为 20º C±1º C，湿度为75％±7％，光照为1333LX（间歇光照，即12h光照， 12h黑暗）。 5）观察：24h，48h各计数一次，记录死亡数及中毒症状，蚓体对针刺无反 应判为死亡，48h后结束试验。每一浓度设置4个重复，总共设置一个不含药 物的对照。
2. 人工土壤试验 (O ECD guideline No. 207)。这是在人工土壤中进行的 试验。这种人工土壤由10% 的苔藓 泥炭细土(PH= 6) , 20% 的高岭粘土( 高岭土大于50% ) , 69% 的工业石英 砂(含50% 以上0. 05～ 0. 2 mm 的细 小颗粒) 和1% 的CaCO 3 (化学纯) 组 成。使用的蚓种仍为E isen ia f oetid aöE isen ia and rei, 试验时间为14 天。利用这种复杂的人工土壤进行试 验的主要目的是尽可能模拟一个蚯蚓 生活的真实环境, 从而使试验结果尽 可能真实地反映污染物在自然界中的 实际影响。
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常规的实验室设备是必需的，具体如下： • 干燥箱; • 立体显微镜; • pH计和光度计; • 合适的精确天平； • 温度控制设备; • 湿度控制设备（不是必需的，若容器有盖子）; • 孵化器或带空调的小房间; • 镊子，钩或环; • 水浴锅。
人工土壤的准备
在试验中所用的人工土壤应当包含以下组分： • 10％的泥炭（尽可能使pH值至5.5〜6.0，无肉眼
试验物质信息
• 在水中的溶解度（water solubility） • 辛醇 - 水分配系数（log Kow） • 蒸气压（vapour pressure） • 有效期和在环境中的特性（例如光解率和水解率，
和应用方式相关）
• 本准则适用于不论其水溶性如何的所有物质。但 该方法不适用于挥发性物质，此处定义为物质的 亨利常数或空气/水分配系数大于1。也不适用于 25 ℃下蒸汽压超过0.0133 Pa的物质。
来具体数过降低泥炭含量至4-5％或相应地增加砂粒含量。 通过有机碳含量的减少，可以降低土壤中的有机 碳对试验化学品的吸附并增加试验化学品接触蚯 蚓的可能性。有证据表明在有机碳含量较低（如 2.7%）的田间土壤试验时，赤子爱胜蚓遵守该繁 殖有效准则，而且经验表明在有机碳含量5%的人 工土壤中同样遵守该准则。
试验的有效性
对照组应满足下列条件才能认为试验结果有效： • 在试验结束时每个重复（包含10条成虫）应当产
生≥30条幼虫； • 繁殖的变异系数应当≤30%； • 在试验开始四周后成虫死亡率应当≤10%。
如果试验不能满足上述条件，那么试验应该终止， 除非可以提供让试验继续下去的正当理由。该理由 应当写进报告中。
在通风的地方把土壤中的这些干燥成分进行充 分混合（例如用一个大型的实验室用混合机）。在 开始试验前，向人工土壤中加入足够的去离子水， 使其达到最大持水量的的40-60%。使得土壤基质 放在手里压紧时不会有水分流出，且没有积水。人 工土壤的最大持水量（WHC）的测定依照附件2或 ISO11274（15）中描述的程序。
Organization for Economic Cooperation and Development
经济合作与发展组织，简称经 合组织(OECD)，是由30个市场经济 国家组成的政府间国际经济组织， 旨在共同应对全球化带来的经济、 社会和政府治理等方面的挑战，并 把握全球化带来的机遇。
介绍
• 此测试准则的目的是评估土壤中的化学品对赤子爱胜
试验原理
使蚯蚓成虫接触一系列浓度的试验物质，这些试 验物质可以是混合到土壤里，若为杀虫剂时，也可以应 用到土壤或者土壤表面。应用方法视试验目的而定。选 择的浓度范围中要包括在八周的时间内可能会引起亚致 死和致死效应的浓度。在接触试验物质的4周后确定成 虫死亡率和对蚯蚓成虫生长的影响。然后从土壤中取出 成虫，再过四周后通过统计土壤中存在的子代数来评估 对蚯蚓繁殖的影响。处理组的繁殖输出应当和对照相比 较，以确定最大无影响浓度（NOEC，在毒性实验中某 物质对受试生物无不利影响的最大浓度）和/或ECx (例 如： EC10, EC50) 。ECx值 (例如： EC10, EC50)应当 在试验选择的浓度范围内，使得ECx的测定来自插补法 而不是外推法。
• 本准则没有考虑试验物质在试验期间发生降解的 可能性。因此，不能认为在整个试验过程中所设 浓度始终是初始浓度。在这种情况下，建议在试 验开始和结束时都对物质进行化学分析。
参考物质
参考物质的NOEC和ECx值必须确定以保证足 够的实验室试验条件和保证试验生物的响应不会随 着时间发生统计学上的改变。建议一年测试参考物 质一次，或者当试验进行频率比较低时，可以与试 验物质的毒性一起测定。多菌灵和苯菌灵已被证明 是对繁殖有影响的合适的参考物质。
可见的植物残株，磨细）； • 20％的高岭土（高岭石含量最好在30％以上）； • 0.3%至1.0％的碳酸钙（CaCO3，细粉状，分析
级）。 • 70％风干的石英砂（取决于CaCO3的需要量），
主要是含有超过50%的50-200μm之间颗粒的细 砂。
注： • 所成分需，的实Ca验CO前3应量当取通决过于测土量壤土基壤质次（级包样括本食确料定）下的
试验说明——设备
应使用玻璃或其它化学惰性材料制成的约一两 升容量的试验容器。该容器应具有约200cm²的横 截面面积，使得500-600g干燥基质添加进去后潮 湿基质在容器内能够达到5-6厘米的高度。容器盖 的设计应允许底物和大气之间有气体交换，并且透 光（例如通过一个穿孔的透明盖），同时还要防止 蚯蚓爬出。如果试验加入基质的量超过500〜600g， 那么容器中的蚯蚓数目也应该按比例增加。
蚯蚓的选择和准备
• 试验中所用蚯蚓为赤子爱胜蚓和安德爱胜蚓。应选择 具有环带的两个月至一年大小的成虫。同一个试验中 所用的蚯蚓要来自同一生长环境，并且大小、虫龄尽 量均匀一致（附件4）。虫龄差别最好不要超过四周。
• 如果试验物质是直接应用于土壤表面或者不必加 水就混合到土壤里，那么所需的水可以在制备土 壤时加入。如果试验物质要先用部分水溶解，那 么所需的额外的水可以和试验物质一起加入（见 后文描述）。
• 在试验开始和结束时的土壤水分含量的测定应遵 循ISO11465，土壤pH值的测定应按照附件3或 ISO10390的描述来进行。对照组和每一个处理 组都要测定。若测试物质为酸性或碱性时，那么 不需要调整土壤的pH值。在整个试验过程中应通 过定期称重容器来监测水分含量（见后文描述）。
蚓(Eisenia fetida，Savigny 1826) 或安德爱胜蚓(Eisenia Andrei ，Andre 1963) 繁殖输出的影响。OECD以前发
布过一个关于蚯蚓的急性毒性试验的准则。一些对蚯 蚓的急性和慢性试验的其他的国际和国家准则已经发 布。 • 赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）/安德爱胜蚓（Eisenia Andrei）通常被认为是土壤动物群尤其是蚯蚓物种的 一个代表。在相关资料中可以获得蚯蚓的生态背景资 料和其在生态毒理学测试中的用途。