11-1-其他类型HPLC色谱法-离子对
第十一章其他类型高效液相色谱法
离子对色谱法
（ion-pair chromatography，IPC）
一、概述
分析对象：
有机酸、碱、两性化合物、盐、强极性化合物
二、分离原理
定义：在色谱体系中加入合适的与样品离子电荷（A+）相反的离子（B-，称为反离子，counterion)，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（呈中性），进而进行分离的一种色谱分离分析技术。
离子对形成与两相间分配示意图
碱性化合物
酸性化合物
吴春勇
Inertsil C18色谱柱（5μm，4.6
mm×150 mm）；
甲醇－5 mmol/L磷酸二氢钾溶
10 mmol/L
液（含有十二烷基磺
酸钠，用磷酸调节pH至
3.5±0.05），（64∶36）为
流动相；
流速：1.0 ml/min；
10ml/min
紫外检测波长：330 nm；
柱温：室温
吴春勇
三聚氰胺极性强，其溶解性决定其不可能使用正相色谱柱进行分离，选
较好
V 乙腈∶V 缓冲液为8∶92的分离度和峰形为较好。
2）流动相pH的确定
考察范围：pH 2.5～4
16.672 min。
16.672min。
高效液相色谱法习题
高效液相色谱法习题第12章高效液相色谱法习题（一）选择题单选题1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( )A 涡流扩散B 分子扩散C 传质阻力D 输液压力2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( )A 提高流动相流速B 采用小颗粒固定相C 提高柱温D 采用更灵敏的检测器3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( )A 流动相种类多B 操作仪器化C 采用高效固定相D 采用高灵敏检测器4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( )A 紫外检测器B 荧光检测器C 示差折光检测器D 电导检测器5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( )A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相黏度较小D 柱温低6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( )A 外标标准曲线法B 内标法C 面积归一化法D 外标法7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( )A 吸附色谱B 反离子对色谱C 亲和色谱D 空间排阻色谱8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( )A 异构体B 沸点相近，官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( )A 涡流扩散B 纵向扩散C 固定相传质阻力D 流动相传质阻力10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( )A 在中性区域B 5一8C 1一14D 2一811．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( )A 乙腈>水>甲醇>正己烷B 乙腈>甲醇 >水>正己烷C 水> 乙腈>甲醇>正己烷D 水>甲醇> 乙腈>正己烷12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( )A 可加快流速，缩短分析时间B 高压可使分离效率显著提高C 采用了细粒度固定相所致D 采用了填充毛细管柱13．液相色谱的H-u曲线（）。
高效液相色谱法的种类 液相色谱操作规程
高效液相色谱法的种类液相色谱操作规程高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液调配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液调配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别。
分别过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5～10μM。
适用于分别分子量200～1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分别同分异构体。
2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分别原理是依据被分别的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分别。
分别过程是一个调配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必需预先用固定相饱和，以削减固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区分常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分别和收集多而杂化。
由于涂布式固定相很难避开固定液流失，现在已很少接受。
现在多接受的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。
正相色谱法接受极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调整组分的保留时间。
常用于分别中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保留时间。
适用于分别非极性和极性较弱的化合物。
(完整版)高效液相色谱习题及答案
高效液相色谱法习题一、思考题1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么?4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？16．以液相色谱进行制备有什么优点？17．在毛细管中实现电泳分离有什么优点？18．试述CZE的基本原理19．试述CGE的基本原理20．试述MECC的基本原理二、选择题1．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。
A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相钻度较小D 柱温低3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL －1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。
第十一章 色谱法
内标法
计算公式 ： mi
Ai f i ' ms As f s '
Ai f i ' mi ms As f s '
mi Ai f i 'ms Ai Ci % 100% 100% 常数 m总 As f s 'm总 As
Ai/As
Wi
内标法标准曲线
内标物的选择:
r21 =
t t
' R2 ' R1
=
V
V
' R2 ' R1
r21 同种固定液对难分离物质对的选择性度量 r21 越大，两组分分离越容易 在气相色谱中， r21的大小仅与固定相种类和 柱温有关。在液相色谱中， r21与固定相、流 动相及柱温有关。 r21是色谱定性的重要参数， 实验室之间可通用。
§2、色谱法基本理论
评价 ：简单，准确。
不适用于试样中组分不能全部出峰的情况。
§2、色谱法基本理论 适用条件： 用于测定试样中个别组分 具体方法：选用一定量的纯物质作内标, 固定内标物和样
品的取样量, 配制一系列具有相同浓度内标物和不同浓度待测 组份纯物质的一系列溶液进行测定, 以Wi(已知的待测组份含量) 对Ai/As (待测物质与内标物的峰面积之比)作图:
(2) 基线 只有流动相经过检测器时，所产生的信号， 反映实验条件的稳定情况。稳定时为直线。
tR 进 样 tM 空 气 峰 tR’
2. 关于保留值的术语 （1） 用时间表示的保留值 tR保留时间：进样柱后出现Cmax值时所需时间 tM死时间: 不与固定相作用的组分的保留时间
t R 调整保留时间:
改变柱温也可改变r21。
§2、色谱法基本理论 三、色谱定性定量方法 1. 定性分析
离子对色谱法
2. 组分溶于水，可用： 组分溶于水，可用： 1）非离子型化合物用反相色谱 SP: -C18, C8等 MP：水或缓冲溶液，甲醇，乙腈， THF的混合液 2) 可离子化化合物用反相离子对色谱 SP：-C18, C8等 MP：水或缓冲溶液（含离子对试剂），甲醇，乙 腈， THF的混合液 3）离子型化合物可用离子交换色谱 或采用反相离子对色谱 SP: -SO3H, -NR3Cl型离子交换剂 MP：缓冲液
1．离子对模型 ．
以有机碱（B）为例。调节流动相pH，使碱 转变为正离子BH+形式，则BH+与流动相中 离子对试剂（烷基磺酸盐）的反离子RSO3生成不荷电的中性离子对，此中性离子对在 固定相和流动相间达到分配平衡。 B + H+ BH+ RSO3Na RSO3- + Na+ BH+ + RSO3- (BH+ RSO3-)m (BH+ RSO3-)s
九．HPLC分析方法 分析方法
（一）定性分析方法 定性分析方法 1．色谱鉴定法：只能对范围已知的化合物定性。 定性原理：同一物质在相同色谱条件下保留时间 （或保留体积或相对保留值）相同。 2．化学鉴定法 收集色谱馏分，在利用化学反应进行鉴定。 3. 两谱联用鉴定法： 离线： 制备HPLC获得纯组分，用UV, IR, MS NMR鉴定； 在线：联用仪
(二）分子量大于1000的组分 二 分子量大于 的组分 采用凝胶色谱法 1. 组分溶于水： 凝胶过滤色谱 SP：水溶性凝胶 MP：水溶液 2. 组分溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 SP：有机凝胶 MP：有机溶剂
Ai f i ms = mi = As f s
Ai f i ms As
fs =1
该法实际为内标一点法
色谱法
载气
检测器
氮气
氢火焰离子化检测器（FID）
检测温度高于柱温
一般 250 ~ 350℃
二、高效液相色谱法（HPLC法）
以液体为流动相的色谱法
（一）HPLC的速率理论
H A Cu
与气相色谱法的差别
GC法 高温（ChP 50 ~ 265℃） 纵向扩散项大（B/u）
HPLC法
室温
传质阻抗项大（Cu）
2. 载体
硅藻土型载体（红色、白色）
3. 毛细管色谱柱 填充型毛细管柱
开管型毛细管柱（WCOT、SCOT）
√
（四）气相色谱仪
气源 进样及气化系统
色谱柱和柱温箱
检测器 热导检测器 氢火焰离子化检测器
电子捕获检测器
ChP（2005）对气相色谱仪的一般要求
色谱柱 固定液 填充柱或毛细管柱（空心柱) 高沸点液体
As Cs f AR CR
内标+样品→计算杂质含量
Ax Cx f As Cs
内标物+ 杂质对照品 →校正因子
内标物+样品 →杂质含量
（2）外标法 供试品→供试品溶液
杂质对照品→对照品溶液
Ax 含量（ x） CR C AR
缺点 不易控制进样量
宜用定量环
（3）加校正因子的主成分自身对照法
2
（二）分离度（R）
除另有规定外，R≥1.5
2 t R2 t R1 R W1 W2
t R2 t R1
（三）重复性（RSD）
尾因子（T）
除另有规定外，T应0.95 ~ 1.05
W0.05h T 2d1
四、GC和HPLC在药品检验中的应用
配系数大的后流出
HPLC法
High performance liquid chromatography; HPLC
药学院药物分析教研室：柯发敏
1
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法 的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而
35
柱的使用和维护注意事项：
高效液相色谱仪
①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动
②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不 应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱 可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。 否则反冲会迅速降低柱效。
④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固 定相被破坏
不稳
恒流泵：在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与
色谱柱引起阻力变化无关，常用
30
泵的使用和维护注意事项
高效液相色谱仪
①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何 杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀， 因此应预先除去流动相中的任何固体微粒 （流动相 和样品必须过滤膜）
②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流 动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时 间的情况下 ③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否 则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产 生漏液
11
3 .离子交换色谱法(ion exchange chromatography)
以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成 的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离
子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不
11-1 盐酸普鲁卡因
一、盐酸普鲁卡因的分析
（一）鉴别 1.水解反应 盐酸普鲁卡因 + NaOH
普鲁卡因 （白色沉淀）
油状物
对氨基苯甲酸钠 + 二乙氨基乙醇 （使湿润的红色石蕊试纸变兰色）
对氨基苯甲酸（白色）
对氨基苯甲酸钠 + HCl
具体的化学反应：
2.红外光谱法 芳伯氨基、苯环、酯基等基团
3. 指示终点的方法 (1) 永停滴定法 溶液 终点前： 无过量 HNO2
检流计 无电流
终点时：有过量 HNO2
有电流（使指针偏离零
永停在某一位置）
(2)
外指示剂法 用KI-淀粉指示剂 指示终点的原理： 2NaO2 + 2KI + 4HCl 2NO + I2 + 2KCl + 2NaCl + 2H2O
Ar-N2+Cl- +
H2N-Ar
Ar-N=N-NH-Ar
+
HCl
一般摩尔比为Ar-NH2 : HCl = 1 :
2.5~6 。
(3) 室温条件下滴定: 温度高反应速度快；每升高10℃加快2.5倍
但太高,可使Ar-N2+Cl- + H2O (4) 滴定管尖端插入液面下滴定
Ar-OH + N2
+
HCl
3.氯化物的反应 • （1）沉淀反应
• （2）氧化还原反应：在硫酸作用下，与二
氧化锰反应生成氯气，能使润湿的碘化钾
淀粉试纸显蓝色。
4.芳香第一胺反应（重氮化-偶合反应）
[鉴别] 取供试品约50mg，加稀盐酸1m1，必要时缓缓煮沸
使溶解，放冷，加0.1mo1/L亚硝酸钠溶液数滴橙黄到
高效液相色谱分离检测技术
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法
1、分离机制
在反相色谱法中,将一种或多种与被测离子电荷相反得离子(称为对离子 或反离子)加到极性流动相中,使其与被测离子结合,形成疏水性(中性或弱极性) 得离子对缔合物 ,而被非极性固定相(有机相)萃取,进入固定相被保留 、因待测 组分离子得性质不同、反离子形成离子对得能力不同和形成离子对疏水性得 不同,导致各组分离子在固定相中滞留时间得不同,因而出色谱柱先后不同,实现 分离、
2、固定相与流动相
(1)固定相
基质 ---合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶 离子交换剂 ----键合得离子交换基团
类型
符号
官能团
强阳离子交换剂 弱阳离子交换剂
SCX WCX
—SO3H —COOH
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
SAX WAX
—N+R3 —NH2
(2)流动相----水缓冲溶液
选择规则 (1)增加流动相中盐得浓度,可以降低待测离子得竞争亲和力, 使其在固定相上得保留时间减少,先出色谱柱;反之,则保留时间 增大,后出色谱柱 、
2、不加校正因子得主成分自身对照法
按上述(1)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供 试品溶液和对照溶液适量,分别进样。除供试品质量标准项 下有特别规定外,供试品溶液色谱图记录得时间应为主成分 色谱峰保留时间得2倍,测量供试品溶液色谱图中各杂质得峰 面积并与对照溶液得主成分得峰面积比较,计算杂质得含量。
在无抑制柱得离子交换色谱中,进入检测器得就是高电导得洗脱剂 NaOH及被洗脱得组分NaX,后者所产生得电导得微小变化被洗脱剂得高本 底所淹没,难于检测。而加了抑制柱后,进入检测器得本底就是电导率很低 得水,因此很容易检测出具有较大电导率得HX。
离子色谱方法及应用
离子色谱中发生的基本过程就是 离子交换，因此，离子色谱本质 上就是离子交换色谱。
阳离子交换：
X m Y Rs Ym X Rs
阴离子交换：
X m Y Rs Ym X Rs
离子交换树脂上可以离解的离子和流 动相中具有相同电荷的的溶质离子之 间进行的可逆交换，根据这些离子对 交换剂有不同的亲和力而被分离。
＋
３５０ ３９ ５０ ７４ ７３ ５３ ６０
Total conductivity ＝
Anion ＯＨ－ Ｆ－ Ｃｌ－ Ｂｒ－ ＮＯ３－ ＰＯ４３－ ＳＯ４２－
（ ＋） ＋
－
１９８ ５５ ７６ ７８ ７１ ８０ ８０
（ ）－
二、离子色谱仪器
淋洗液
进样阀 泵
色谱柱
检测池
抑制器 检测器
泵液 进样
分离
检测
安装在电导池之前 提高待测离子的电导率：
提高灵敏度
Na+, Cl-
H+, Cl-
降低背景电导 (淋洗液) :
减少噪音
Na+, HCO3Na+, OH-
H2CO3 H2O
极限摩尔电导值
（unit：μS/m equivalent）
Cation Ｈ＋ Ｌｉ＋ Ｎａ＋ Ｋ＋ ＮＨ４＋ Ｍｇ ２＋ Ｃａ２＋
12943
阳极 废液
Na+, X- 在 NaOH 淋洗液中
阴极
废液
H2O, O2H+来自H+ + O2
H2O
H+ + OH-
H2O
H+, X -
Na+
H+ , X- in H2O