高效液相色谱法培训课件
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高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
《高效液相色谱法》课件
– 分离机理：组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面 活性中心
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
HPLC高效液相色谱培训__PPT
HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程 中改变流动相的组成或浓度。 高压梯度 ①线性梯度; ②阶梯梯度 低压梯度
22
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
1
Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
10
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
11
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
28
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
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Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
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第二节 高效液相色谱仪器
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第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
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Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
最新安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训ppt课件
• 从 Integration 菜单选择积分或自动积分 • 选择积分工具。 • 运行一个包括数据分析的完整方法。
Slide 54
自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
Slide 34
泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
Slide 35
自动进样器的扩展功能
Slide 36
色谱柱信息的输入
Slide 37
VWD停泵扫描采集光谱
Slide 59
Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱
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自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
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泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
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自动进样器的扩展功能
Slide 36
色谱柱信息的输入
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VWD停泵扫描采集光谱
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Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱
HPLC高效液相色谱法培训解析PPT课件
• 1．HPLC分析所用水均需纯化处理，用新鲜二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理。 • 2．流动相需经过滤、脱气后方可使用。样品需经过滤或高速离心后方可进样分析。 • 3．做完实验后，反相色谱柱需用甲醇冲洗20~30 min。若流动相中含盐类或缓冲溶
液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化 到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。
48
第48页/共112页
HPLC分析基本操作
• 4．平衡：升高流速（常规分析柱一般至 1 mL/min），大约15min后，换上准备的流动相（若流动相含盐或甲醇比例较低， 中间需适当过渡），待基线走稳。
• 5．仪器面板或色谱工作站设置分析条件，如设置泵参数：工作流速、流动相比例、 高压限和低压限；设置检测器参数：如检测波长（nm）、灵敏度（AUFS）等； 编辑样品名、采集时间、进样体积等。
无法正常工作。
17
第17页/共112页
梯度洗脱装置
• 用途：梯度洗脱。 等度(isocratic)
• 高效液相洗脱方式 梯度(gradient)
低压梯度（外梯度） • 梯度洗脱方式
高压梯度（内梯度）
18
第18页/共112页
低压梯度
• 在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵 将流动相以一定的流量输出至色谱柱。
将流动相置于超声波清 洗机中，用超声波振荡 10~30min，即可。
吹氦脱气
用在液体中比空 气中溶解度低的氦 气，以60mL／min 的流速缓缓地通过 流动相10~15min， 除去溶于流动相中 气体。
12
第12页/共112页
高压输液泵
• 是HPLC系统中最重要的部件之一。 • 输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。
液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化 到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。
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第48页/共112页
HPLC分析基本操作
• 4．平衡：升高流速（常规分析柱一般至 1 mL/min），大约15min后，换上准备的流动相（若流动相含盐或甲醇比例较低， 中间需适当过渡），待基线走稳。
• 5．仪器面板或色谱工作站设置分析条件，如设置泵参数：工作流速、流动相比例、 高压限和低压限；设置检测器参数：如检测波长（nm）、灵敏度（AUFS）等； 编辑样品名、采集时间、进样体积等。
无法正常工作。
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第17页/共112页
梯度洗脱装置
• 用途：梯度洗脱。 等度(isocratic)
• 高效液相洗脱方式 梯度(gradient)
低压梯度（外梯度） • 梯度洗脱方式
高压梯度（内梯度）
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第18页/共112页
低压梯度
• 在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵 将流动相以一定的流量输出至色谱柱。
将流动相置于超声波清 洗机中，用超声波振荡 10~30min，即可。
吹氦脱气
用在液体中比空 气中溶解度低的氦 气，以60mL／min 的流速缓缓地通过 流动相10~15min， 除去溶于流动相中 气体。
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第12页/共112页
高压输液泵
• 是HPLC系统中最重要的部件之一。 • 输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。