生化分离技术 第二章 细胞的破碎
合集下载
生物分离工程5(细胞破碎技术)
01
02
03
04
生物制药
用于提取和分离药物、蛋白质 、酶等生物制品。
食品工业
用于提取植物和动物细胞中的 营养成分，如植物油、动物蛋
白等。
环境科学
用于处理废水中的有害物质， 如重金属、有机污染物等。
农业领域
用于提取植物细胞中的有用成 分，如植物激素、天然色素等
。
02
细胞破碎技术的基本原理
物理法
01
表面活性剂法
利用表面活性剂改变细胞 壁的通透性，使细胞内容 物释放出来。
有机溶剂法
利用有机溶剂如丙酮、乙 醇等溶解细胞壁，使细胞 内容物释放出来。
生物法
酶解法
利用酶如溶菌酶、蛋白酶等将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细菌分泌的蛋白酶
利用某些细菌分泌的蛋白酶将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细胞破碎技术的历史与发展
最早的细胞破碎技术可以追溯到19世纪末，当时人们开始使用机械研磨法破碎细胞。
随着科技的发展，出现了多种新型的细胞破碎技术，如超声波破碎、高压均质破碎、 化学渗透压破碎等。
近年来，随着生物技术的快速发展，细胞破碎技术也在不断改进和完善，以满足更 高效、环保和低成本的需求。
细胞破碎技术的应用领域
细胞破碎过程需要消耗大量的能量，这可能导致生产成本的增
加。
可能引起样品污染
02
在破碎过程中，如果设备或条件控制不当，可能会引起样品的
交叉污染或样品中原有成分的降解。
对细胞的损伤
03
高强度的破碎条件可能会对细胞内部结构造成损伤，影响后续
的分离和提取过程。
04
细胞破碎技术的应用案例
在制药行业中的应用
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
细胞的破碎
该区域通透性增加
表面活性剂
❖ 天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 ❖ 合成的表面活性剂 离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴
化铵（阳离子型） 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等
表面活性剂Triton X-100－非离子型清洁剂 ❖ 其作用部位主要是内膜的双磷脂层。 ❖ 对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， ❖ Triton X-100常与其它试剂混合使用。
目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理E. coli 基因工程菌，渗透出重组蛋白质。
复合试剂
❖ 根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有 效的提高胞内物质的释放率。
如：单独用0.1M的胍处理E. coli，可释放1％的胞内蛋白，用
0.5% Triton X-100可释放4％胞内蛋白，二者结合使用，在 同样时间内可使53％的胞内蛋白释放。
蜗牛酶适于酵母细胞的处理
自溶作用
❖ 通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自 身的酶的方法也是一种酶溶法，称为自溶。
❖ 自溶作用是酶解的另一种方法 ❖ 微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚
合结构的酶，以便使生长过程进行下去。 ❖ 改变微生物的环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生
物理法和化学法的比较
物理破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性 失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。
化学破碎法缺点：
A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
3.2 细胞破碎方法
细胞的破碎与分离ppt课件
条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
20
1)机械法
珠磨法 高压匀浆法 超声波法
21
1) － 1 固体剪切方法 珠磨法 (bead mill)
原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm） 一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间 的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量 一般采用夹套冷却的方式带走。 适于绝大多数微生物细胞的破碎，更适合于真菌 菌丝和藻类。
路线一A
本章内容
浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 )
2
主要内容
概述 细胞破碎 细胞壁的结构和化学组成
细胞壁的破碎
方法 试剂 设备
3
1 概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
19
3.2 细胞破碎的方法
分 类 作用机理
珠磨法 机 械 法 高压匀浆法 固体剪切作用 液体剪切作用
适 应 性
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和革兰氏阳性菌
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
22
WSK卧式高效全能珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
23
珠磨法 (bead mill)
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎 机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机 ( 瑞士 WAB公司 和德国西门子机械公司制造)。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、 减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产 生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。
20
1)机械法
珠磨法 高压匀浆法 超声波法
21
1) － 1 固体剪切方法 珠磨法 (bead mill)
原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm） 一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间 的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量 一般采用夹套冷却的方式带走。 适于绝大多数微生物细胞的破碎，更适合于真菌 菌丝和藻类。
路线一A
本章内容
浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 )
2
主要内容
概述 细胞破碎 细胞壁的结构和化学组成
细胞壁的破碎
方法 试剂 设备
3
1 概述
不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外
19
3.2 细胞破碎的方法
分 类 作用机理
珠磨法 机 械 法 高压匀浆法 固体剪切作用 液体剪切作用
适 应 性
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和革兰氏阳性菌
超声破碎法
液体剪切作用
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作
22
WSK卧式高效全能珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
23
珠磨法 (bead mill)
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎 机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机 ( 瑞士 WAB公司 和德国西门子机械公司制造)。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、 减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产 生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。
第二章-细胞的分离与破碎-2精品PPT课件
及微小的原生动物、单细胞海藻、真菌、苔藓等。
动物细胞无细胞壁，只有细胞膜，易于破碎。植物细胞和微生 物细胞的细胞膜外还有一层坚固的细胞壁，破碎较困难。
微生物细胞的细胞壁固定细胞外形，保护细胞免受机械损伤或 渗透压破坏。细胞膜主要由蛋白质和脂质组成，二者之和占细胞膜 构成成分的80-100%厚度较薄(7～10nm)，易受渗透压冲击而破碎。 细胞破碎阻力主要来自细胞壁。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因
此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs
为
s
2
2
d
2 P
(
S
L)N 2r
9 L
或
s
dr dt
Sr
2 .N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业 中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。
机械破碎
• 高压匀浆 • 珠磨 • 撞击破碎 • 超声波破碎
机械破碎
机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快，是 工业规模细胞破碎的主要手段。细胞破碎器与 传统的机械破碎设备的操作原理相同，主要基 于对物料的挤压和剪切作用。根据细胞为弹性 体、直径小、破碎难度大和以回收胞内产物为 目的、需低温操作等特点，细胞破碎器采用了 特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有。
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞
大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞
大小/μm
2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30
离心力 实验室 工业规模
动物细胞无细胞壁，只有细胞膜，易于破碎。植物细胞和微生 物细胞的细胞膜外还有一层坚固的细胞壁，破碎较困难。
微生物细胞的细胞壁固定细胞外形，保护细胞免受机械损伤或 渗透压破坏。细胞膜主要由蛋白质和脂质组成，二者之和占细胞膜 构成成分的80-100%厚度较薄(7～10nm)，易受渗透压冲击而破碎。 细胞破碎阻力主要来自细胞壁。
离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因
此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs
为
s
2
2
d
2 P
(
S
L)N 2r
9 L
或
s
dr dt
Sr
2 .N
离心分离法
• 差速离心 • 区带离心
差速离心分级
1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业 中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。
机械破碎
• 高压匀浆 • 珠磨 • 撞击破碎 • 超声波破碎
机械破碎
机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快，是 工业规模细胞破碎的主要手段。细胞破碎器与 传统的机械破碎设备的操作原理相同，主要基 于对物料的挤压和剪切作用。根据细胞为弹性 体、直径小、破碎难度大和以回收胞内产物为 目的、需低温操作等特点，细胞破碎器采用了 特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有。
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞
大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞
大小/μm
2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30
离心力 实验室 工业规模
细胞破碎和生化分离技术-PPT
缺点: A、影响因素多,细胞种类、浓度和 处理时间、探头材料和形状; B、有效能量得利用率低; C、产热大,需控温; D、不易放大,仅应用于实验室规模 得细胞破碎。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
机械破碎法总结
• 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围 (包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工 业用)
碟片式离心机
• 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了 许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效 率。
• 就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 • 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥
形碟片。 • 碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。
碟片式离心机工作原理
浓度。 • 微滤技术有着广泛应用和众多得优点。
微滤得操作模式
• 无流动操作模式和错流过滤操作模式
微滤设备
• 板框式膜过滤器 • 管式膜过滤器 • 中空纤维式膜分离器 • 螺旋卷式膜分离器
离心技术
• 一、离心分离得基本原理 • 二、离心机得类型 • 三、离心方法 • 四、离心条件得确定 • 五、影响离心效果得主要因素与控制
心机 • 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式……
离心机得种类与用途
按速度和离心力: 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g 以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离; 2、高速(冷冻)离心机 1×104～2、5×104rpm,相对离心力104～ 105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离; 3、超速离心机 转速2、5～8×104rpm,相对离心力5×105g;用于 DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数 和相对分子量测定等。
《细胞破碎分离》ppt课件
法
珠捣碎
细胞的大规模处置
超声波法 使细胞遭到液体剪 适中 昂贵 细胞悬浮液小规模
切力而破碎
处置
2.非机械法
非机械方法很多 1) 生物法-酶溶解〔enzyme lysis〕 2) 化学法溶胞〔chemical treatment〕 3) 物理法 浸透压冲击〔osmotic shock〕 冻结和融化〔freezing and thawing〕 枯燥法 其中酶溶解法和化学溶胞运用最广
大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖 构成，少数含纤维素。
红面包霉菌细胞壁构造： 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的
混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状构造 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。
真菌细胞壁的构造表示图
真菌细胞壁的强度：主要决议于聚合物的网状构 造，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维 状构造，所以强度更高。
➢ 缺陷： ➢ 超声波产生的化学自在基能使某些敏感性活性
物质失活。 ➢ 对冷却的要求非常高，所以不易放大，但在实
验室小规模细胞破碎中常用。
不同机械破碎方法的比较
技术
匀浆法 (孔型)
原理
效果 本钱
举例
使细胞遭到液体剪 猛烈 适中 细胞悬浮液大规模
切力而破碎
处置
研磨破碎 细胞被玻璃珠或铁 猛烈 廉价 细胞悬浮液和植物
度，研磨剂量，颗粒大小，以及温度等 相关。
3〕超声波破碎
作用机理：液体剪切力 超声波破碎法
〔Ultrasonication)利用超 声波振荡器发射的15-25kHz 〔千赫〕的超声波探头处置 细胞悬浮液。 超声波的细胞破碎效率与细 胞种类、浓度和超声波的频 率有关。
超声波破碎的机理
生化工艺——第二章细胞破碎
²
第二节
细胞壁的破碎
一、珠磨破碎 破碎原理：利用在高速搅拌作用下， 破碎原理：利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相 被破碎。 互磨擦碰撞而受剪切力被破碎。 破碎作用遵循一级动力学定律： 破碎作用遵循一级动力学定律：
1 ln = kt 1− x
特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低， 特点：适用范围较广；但有效能量利用率很低，设 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力； 计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。
1 − x = exp( − kt )
影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 影响因素：细胞种类、浓度和超声波的能量等。 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广； 特点：是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大， 能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多 在实验室使用。 在实验室使用。
细胞壁的破碎方法总结
方法 机 械 法 技术 原理 效果 成本 举例 动物组织及 动物细胞 匀浆法（片型） 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器 劈碎 研磨法 超声波法 细胞被研磨物 磨碎 用超声波的空 穴作用使细胞 破碎 适中 适中 适中 便宜 适中 昂贵 细胞悬浮液 小规模处理 细胞悬浮液 大规模处理
匀浆法（孔型） 匀浆法（孔型） 须使细胞通过 的小孔， 的小孔，使细 胞受到剪切力 而破碎 珠磨破碎法 细胞被玻璃珠 或铁珠捣碎
总结 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠 磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机适用范围较广，可用于酵母和细 菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.
三、超声波破碎 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用， 破碎原理：超声波作用下液体发生空化作用，产生 使细胞破碎。 极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 ²
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第二节 细胞壁的破碎
破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一. 在用球磨法破碎细胞的过程中,影响因素有以下几个方 面: (1)搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加,剪切力增大, 细胞破碎量增大,但是高的能量消耗,高的热量产生和磨球 的磨损以及因剪切力引起产物失活,因此对于给定处理量和 对蛋白质的释放要求下,存在着最佳效率点.实际生产中, 搅拌器外缘速率控制在(5～15)m/s之间.
1 x = exp(kt )
式中 x——为释放蛋白质的分率; k——为蛋白质释放常数,min-1; t——为超声波发射时间,min.
(2-5)
蛋白质释放常数k取决于输入声能,由实验确定.对于 从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液),用190声瓦的 20HZ声频的超声波处理时: k=b(P-P0)0.9 (2-6)
第二节 细胞壁的破碎
式中 b——为常数; P——为输入功率,J/(kg.s); P0——为由超声波引起的空穴的临界功率,J/(kg.s). 当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量,当产生的气 泡破裂时,绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收, 为避免高温,在破碎池中设计了冷却水夹套,并在开始时先 把悬浮液冷却至0℃～5℃,并不断将冷却液连续通过夹套, 短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作,以防止高温使 蛋白质变性. 为提高破碎效率,在破碎池中可添加细小的球粒(可以 是钢制的或玻璃的),以产生"研磨"效应,提高细胞破碎 率. 超声波破碎是实验室常用的一种普通方法,由于向大量 的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难,因此在工业还未 采用.
第二节 细胞壁的破碎
Y % = [ ( N 0 N ) N 0 ] ×100%
式中 N0——原始细胞数量; N——经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数 量. N0和N可由直接计数法和间接法求得. 直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计 数法进行计数. 间接计数法是在细胞破碎后,将悬浮液离心分离,除去细 胞碎片,未破碎的细胞及其他悬浮物,然后对清液进行蛋白质 含量或酶的活性进行分析.通过细胞释放出来的化合物的量R 与所有细胞理论最大释放量Rm的比值R/Rm,求出破碎率. (2-3)
第一节 细胞壁的结构与组成
图2-1 细菌细胞壁的主要组分
第一节 细胞壁的结构与组成
革兰氏阴性菌细胞壁(见图2-3)细胞壁较薄,有1～2 层肽聚糖片,在肽聚糖层外尚有脂蛋白,脂质双层,脂多糖 三部分.脂蛋白的功能是将外膜固定于肽聚糖层,脂类和蛋 白质等在稳定细胞结构上非常重要,如果被抽提,细胞壁将 变得很不牢固.
一,球磨法
球磨机是破碎微生物细胞的常用设备,一般有立式 (见图2-5)或卧式(见图2-6)两种,在磨腔中装入小玻璃 球或小钢球,由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬 浮物和小磨球而产生剪切力,将细胞破碎.
第二节 细胞壁的破碎
图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨
图2-6 Netzsh LM20砂磨机
2 2-7 高 压 匀 浆 机 的 排 出 阀 装 置 图
第二节 细胞壁的破碎
(1)温度 破碎率随着温度的升高而增加.当悬浮液中酵 母浓度(450～750)kg/m3,操作温度由5℃提高到30℃时,破 碎率约提高1.5倍.但是高温破碎只适用于非热变性产物,如 果温度高于40℃时,蛋白质在破碎过程中会发生变性.因此, 进口处用干冰来调节温度,使出口处的温度维持在20℃左右. (2)压力 操作压力的合理选择非常重要.提高压力需增 加消耗,压力每升高100Mpa会多消耗3.5KW能量;压力每升高 10Mpa,温度将提高2℃;另外压力过高将引起高压匀浆机排出 阀座剧烈磨损.通常非结合的酶,操作压力为5.45×107Pa, 菌体浓度10%～20%(质量分数),处理一次即可.在操作压力 为55Mpa的条件下,通过6次匀浆假丝酵母得到30%可利用蛋白 质. 一般来讲,高压匀浆机最适合于酵母和细菌.
Rm d ln = kNP Rm R
(2-4)
第二节 细胞壁的破碎
式中R为蛋白质释放量;Rm为蛋白质最大释放量;N为悬 浮液通过匀浆器的次数;P为操作压力;k为与温度有关的速度 常数;指数d值对于有机体是抵抗破碎能力的一种量度,不同 的有机体其值不同,如酿酒酵母d=2.9,大肠杆菌d=2.21. 图 在高压匀浆机操作中,主要影响因素有:
将上式由开始工作到t时刻积分,可得:
∫
R
0
t dR = ∫ kt Rm R 0
Rm = ln 1 = kt ln ( Rm R) x 1
(2-2)
式中 x——为R/Rm,t时刻释放蛋白质的分数,x数值越大, 表示破碎程度越高. 一般用破碎率Y表示破碎程度.破碎率定义为被破碎 细胞的数量占原始细胞的百分数.
第二节 细胞壁的破碎
二,高压匀浆法
高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种.它的主要 设备是高压匀浆机,它有一个高压位移泵和一个可调节进 料速度的针形阀(见图2-7).当菌体悬浮液经过高压泵加 压后,通过阀芯与阀座之间的通道时,悬浮液突然改变方 向,向球撞击.在通过阀门时产生高剪应力,向环撞击时 产生巨大的冲击力,将细胞破碎,然后排出.其破碎率服 从一级反应定律.
第一节 细胞壁的结构与组成
二,真菌和酵母
真菌的细胞壁含有几丁质(N-乙酰葡萄糖胺的一种聚合 物)纤维素,葡聚糖,甘露聚糖,半乳聚糖等.此外还有蛋 白质,类脂,无机盐等.而酵母的细胞壁(见图2-4)由特 殊的纤丝状物质构成,主要成份是甘露聚糖(31%),葡聚 糖(29%),蛋白质(13%)和类脂质(8.5%).酵母中的葡 聚糖的为 β-1,6-葡聚糖通过β-1,3键与D-葡萄糖中第一侧 链交连而不溶于水. 所有的真菌细胞壁是由不同的多糖链相互缠绕成一股又 粗又壮的链,嵌入在蛋白质及类脂和一些小分子的多糖基质 中,看起来像钢筋混凝土,从而解释了真菌细胞壁的机械强 度和硬度.
第二节 细胞壁的破碎
三,超声破碎法 超声破碎法是另一种液相剪切破碎法.其实验室装置见 图2-8 .
图 2-8 连 续 破 碎 池 的 结 构 简 图
第二节 细胞壁的破碎
当通过超声探头向悬浮液输入声能,大量声能转化成弹 性波形式的机械能,引起局部的剪切梯度,使细胞破碎.在 超声波破碎过程中,蛋白质释放遵循一级反应定律:
第二节 细胞壁的破碎
破碎作用遵循一级动力学定律:
dR = k ( Rm R) dt
(2-1)
式中 R——t时间内释放的蛋白质数量(mg/g); Rm——100% 破 碎 细 胞 释 放 的 蛋 白 质 数 量 (mg/g). k——破碎的比速率,s-1; t——球磨机工作的时间,s.
第二节 细胞壁的破碎
一,细菌
细菌的细胞壁坚韧而有弹性,由不同的肽链结合组成质 量均匀的网状结构,其厚度因细菌不同而有差异,可抵御外 界的机械损伤,并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏.
第一节 细胞壁的结构与组成
细胞壁的主要成份是肽聚糖,由N—乙酰葡糖胺(见图 2-1a)和N—乙酰胞壁酸(见图2-1b)构成双糖单元,以β (1-4)糖苷键连接成大分子.N—乙酰胞壁酸分子上四肽 侧链,相邻葡聚糖纤维之间的短肽通过肽桥或肽键连接起 来,组成机械性很强的网状结构,像胶合板一样,粘合成 多层.各种细菌细胞壁酞聚糖结构均相同,但在四肽侧链 的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异. 革兰氏阳性菌细胞壁(见图2-2)较厚,约20～80nm. 含15～50层肽聚糖片层,每层厚度1nm,约占细胞干重的 50%～80%.此外,尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸.
第二节 细胞壁的破碎
五,化学渗透法
用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方 法称为化学渗透法.例如在发酵液中添加酸碱,脂溶性有机溶 剂(甲苯,丁醇,丙酮,氯仿等)和某些表面活性剂,改变菌 体细胞壁或膜的通透性,使细胞壁破裂,使胞内物质释放出来. 酸碱用来调节溶液的pH值,改变细胞所处的环境,从而 改变两性产物-蛋白质的电荷性质,使蛋白质和蛋白质之间或 蛋白质与其他物质之间的作用力降低而溶解到液相中去,便于 后面的提取. 有机溶剂被细胞壁吸收后,会使细胞壁膨胀或溶解,导致 破裂,把胞内产物释放到水相中去.选用溶剂的基本原则是与 细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂.
第二节 细胞壁的破碎
(4)温度 操作温度控制在5℃～40℃范围内对破碎 物影响不大.但在研磨过程中会产生热量积累,为控制磨 室温度,在搅拌器和磨室外筒分别设计有冷却夹套,通过 冷却剂来调节磨室的温度. (5)流量 高流量有利于降低能耗,降低细胞的破碎 程度和释放蛋白质的产量. (6)微生物特性 一般来说酵母比细菌细胞处理效果 好.因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一,而且细菌细 胞的机械强度比酵母要高.一台20L球磨机在最适条件下, 每小时可加工200kg面包酵母,而在同样条件下,处理细菌 细胞仅为10～20kg.
第二节 细胞壁的破碎
表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂,同时又能在相界 面上定向并改变界面的性质的某些有机化合物.表面活性剂分子中间 同时具有憎水基团和亲水基团,当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达 到一定时,它的分子会产生聚集生成胶束,憎水端向内,亲水端向外. 憎水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心,而亲水基团则向 外层,使膜的通透性改变或使细胞壁溶解,从而使胞内物质释放到水 相中.此法特别适用于膜结合蛋白酶的溶解.表面活性剂按分子结构 中带电性的特征可分为:阴离子型(如直链烷基苯磺酸盐),亲水基 团带有负电荷;非离子型,如碳原子数在12以上的高碳脂肪醇,在分 子中没有带电荷的基团,其水溶性来自于分子中所具有的聚氧乙烯醚 基和端点羟基;阳离子表面活性剂,亲水基团带有正电荷;两性表面 活性剂,在水中同时具有可溶于水中的正电性和负电性基团.一般来 说,使用离子型表面活性剂比非离子型提取效果要好一些.
第一节 细胞壁的结构与组成
三,藻类
藻类的细胞壁更为复杂,其主要结构成份,是纤丝状的 多糖类物质. 图