realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点
RT-PCR and real-time PCR
70 ℃加热2分钟，置于冰上2分钟 M-MuLV逆转录酶 1 μl
42 ℃加热50分钟 70 ℃加热10分钟，酶失活
两步法反应：
第二步反应体系
10×PCR Buffer (含Mg2+) cDNA 正义引物（P1）
反义引物（P2） Taq DNA聚合酶 dNTP ddW
第二步反应条件
94℃ 预变性 3-5min 94℃ 变性 20s 50-65℃ 退火 30s 72℃ 延伸 1min
实时荧光定量PCR
（一）定义：在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号累积实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对起始 模板进行定量分析的方法 。
（二）实时原理
1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时 检测。
2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲 线的分析对起始模板进行定量分析。
手套。
2. RNase 的又一污染源是取液器。根据取液器制造商
的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC 配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达 到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
（1） 塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明
RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不 必再处理。
RNA检测 (1) 测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。 OD260/OD280在1.8-2.0 。 (2) 进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定 RNA的完整性和污染情况。
28S —18S —
RT-PCR和realtimePCR原理及步骤
装载
将样品和试剂装入PCR板或 realtimePCR板中。
进样
将PCR板或realtimePCR板放 入仪器中开始反应。
评价和解读结果
1
数据分析
利用专业软件对荧光信号和扩增曲线进
基因表达计算
2
行分析。
比较样品之间的基因表达水平。
3
标准曲线制备
用标准品建立浓度和荧光信号之间的关 系。
实验控制和误差处理
1 防止样品污染
2 合理设计实验
避免引入外源DNA或RNA。
提前考虑样品数、重复次 数和阴性对照。
3 数据验证
CR的优缺点比较
RT-PCR
灵敏度高，适用于低表达基因，但结果需要后续凝 胶电泳分析。
realtimePCR
结果即时可见，无需后续分析，但对样品纯度和荧 光信号分析要求较高。
RT-PCR和realtimePCR的应用领域
医学诊断
RT-PCR和realtimePCR用于病 原体检测、基因突变分析和 疾病诊断。
基因表达分析
这两种技术用于研究基因调 控、蛋白质表达和细胞信号 传导。
环境监测
RT-PCR和realtimePCR可用于 检测环境中的微生物和污染 物。
RT-PCR和realtimePCR的原理
应用案例
• 基因表达差异分析 • 疾病诊断 • 新药研发 • 环境污染监测
发展前景
随着技术的不断改进，RT-PCR和realtimePCR在医学、生物学和环境科学等领 域都会有更广泛的应用。
结论与展望
RT-PCR和realtimePCR是重要的分子生物学技术，为科学研究、医学诊断和环 境监测提供了强大的工具。
RT-PCR和realtimePCR原理 及步骤
Real-Time_PCR技术
TaqMan法优缺点
优 点
对目标序列的高特异性 ---阴性结果确定 设计相对简单 ---与目标序列某一区域 互补 重复性比较好
缺 点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针
2：SYBR Green I 法（荧光染料法）
在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号， 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号， 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
Real-TimePCR技术
许培祥
2013-10-24
主要内容
• Real-timePCR概述 • Real-timePCR的方法 • Real-time PCR定量方法
Real-timePCR概述
1.Real-time PCR
实时荧光定量PCR （Real-time quantitative
PCR ）是在PCR反应体系中加入荧光基团，
Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信
号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数.
C(t) value
Ct值与模板起始浓度的关系
• 模板起始浓度越高，Ct值越小
• 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达
• 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达
Ct值的特点
Ct值的特点： 同一个样品重复96次PCR的扩增曲线，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性
RT-PCR定量的方法 • 标准曲线法的绝对定量 • 相对定量： 比较Ct法---最常用 双标准曲线法 比较定量法
1：标准曲线的绝对定量
通过已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中 所含的模板量
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
总RNA的提取与RT、Realtime-PCR
总RNA 的提取与RT、Realtime - PCR一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。
获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。
由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。
再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。
1 . RNA提取的最大影响因素-RNA酶但是由于RNA酶（RNase）广泛存在且稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压等。
RNase催化的反应一般不需要辅助因子，因而RNA制剂中只要存在少量的RNase就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，所以RNA的制备过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。
外源性的RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的RNase 也会造成污染。
这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试齐叽而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNaseo2 .常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPQ：是一种强烈但不彻底的RNase抑制剂。
它通过和RNase的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNase抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNase失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNase有强烈的变性作用。
*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNase结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNase的活性。
*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin是RNase的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNase结合，使其失活。
real-time pcr名词解释
real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
·
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实验技术：RealtimePCR
实验技术：RealtimePCR作为在实验室奋斗的“奋青”们，都知道Realtime PCR(RT-PCR)是并列于western blot的基础实验之一。
不会做PCR的人都不好意思说自己在搞科研，呵呵哒。
作为一门核心技术，也是相对来说出结果快速的技术，本次小笔将一改逗比风格，高冷正经脸来分享该技能，各位接好了啊。
RT-PCR原理的话简单来说，就是采用荧光基团标记的特异性探针来跟踪PCR产物，做到全程监控，后期结合电脑软件分析定量得出待测样品的初始量。
步骤如下：1. RNA提取和测定（1）平衡：-80℃取出TRIZOL裂解的细胞（也可以当时裂解；如果是组织，需要超声破碎后再进行后续步骤），置于室温使其完全溶解（3-5min左右）；（2）分离：随后按照裂解液：氯仿（5：1）的比例加入氯仿，剧烈震摇30 S（自认为手劲儿大的就手动摇，扛不住的话也可以涡旋仪，当然我是一直手动的哈哈）后，室温静置3min，4℃，13,000rpm离心10 min，取上清置于干净的RNAfree的EP管中。
【小提示：取上清的时候很容易将中间层的絮状物吸出，导致蛋白质污染，可以采用PhaseLock Gel的离心管，有效分层水相和有机相，避免吸取的上清混杂杂质。
】（3）沉淀：在上清中加入等体积的异丙醇，轻微上下翻动混合，冰上孵育20min后，4℃，14,000rpm离心20 min，管底部有可见沉淀，即为RNA（如果裂解的细胞较少，沉淀可能肉眼看不见）。
（4）清洗干燥：轻柔的倒掉上清，每管加入1 ml 75%乙醇溶液（采用DEPC水配置），混匀，4℃，14,000 rpm离心15 min。
小心倒掉上清，于超净台边缘干燥5min。
（5）溶解测定：根据具体的RNA的量，加入适当的DEPC水溶解（沉淀可见，加入的DEPC水多一些，反之少加），静置后即可于nanodrop检测浓度（一般我们暂定A260/A280比值在1.8-2.0即可使用）。
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real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。
缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
方法二：TaqMan---水解型杂交探针**5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等**3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)** 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光， R 与Q分开，发荧光**Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94 ℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标;委托公司标记，价格较高;不易找到本底低的探针Real-time PCR与RT-PCR比较2009-08-20 16:50:02 来源:未知【大中小】评论: 条摘要：Real-time PCR与RT-PCR是两种不同的PCR方法，适用范围也不同。
R eal-time PCR中文译作实时聚合酶链反应，是一种最新发展的定量PCR技术。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩Real-time PCR与RT-PCR是两种不同的PCR方法，适用范围也不同。
Real-time PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。
该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA 拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。
根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。
Real-time PCR所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。
RT-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA 酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。
对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
但二者的基本原理是相同的，即PCR技术。
RT-PCR原理与实验技术2009-08-20 16:25:05 来源:未知【大中小】评论: 条摘要：一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。
因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的一、知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。
因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。
2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c、 3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。
f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。
还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。
常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。
2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA 降解。
然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。
3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。
三、RNA的提取方法：RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。
RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。
但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。
因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。
RT－PCR步骤：1、RNA的提取：2、cDNA的合成：逆转录体系的组成：DEPC处理水 8ul10mM dNTPs 2.5ulRandom primers 0.4ulRNasin 0.5ul总RNA 2.5－3ug70℃ 5min速置冰水中冷却再加：5*逆转录buffer 5ul逆转录酶(M-MLV) 1ul(200U)加水至25ul37 ℃ 60min90℃ 5min3、PCR扩增：50ul PCR体系的组成：10×PCRbuffer 5ulMgCl2 3ul(2.0mM)10mMdNTPs 1ulsense primer 1ul(1umol/l)antisense primer 1ul(1umol/l)cDNA 1.5ulDEPC处理水 36.7ulTaq 酶 0.8ul(2.4U)总体积 50ul 4、PCR反应条件：94 ℃ 5min94 ℃ 1min退火温度 40sec72 ℃ 50sec 2 29 cycles72 ℃ 7min4 ℃ 0sec四、PCR条件的优化：PCR条件的优化主要是①引物退火温度的调节，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。