二代测序简介
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂（原创实用版）目录1.二代基因测序的概述2.二代基因测序的流程3.二代基因测序的试剂4.二代基因测序的应用领域5.我国二代基因测序的发展状况正文二代基因测序的概述二代基因测序，也称为下一代基因测序（NGS），是继 Sanger 测序之后发展起来的一种高效、快速的基因测序技术。
二代基因测序技术具有高通量、低成本、高精度等特点，使得基因测序在全基因组测序、转录组测序、基因表达谱分析等领域得到广泛应用。
二代基因测序的流程二代基因测序的流程主要分为以下几个步骤：1.样品准备：将待测样品提取出 DNA，并进行质量和浓度检测。
2.文库构建：将 DNA 片段进行断裂、末端修复、连接接头、PCR 扩增等步骤，构建出文库。
3.测序：将文库片段进行高通量测序，通常采用 Illumina、PacBio、Oxford Nanopore 等技术。
4.数据处理：对测序得到的原始数据进行质量控制、去除接头序列、过滤低质量序列等步骤，得到高质量的序列数据。
5.数据分析：将高质量的序列数据进行比对、拼接、注释等步骤，得到最终的测序结果。
二代基因测序的试剂二代基因测序所需的试剂主要包括：DNA 提取试剂盒、文库构建试剂盒、PCR 扩增试剂、测序反应试剂等。
其中，文库构建试剂盒通常包括末端修复酶、连接酶、接头等。
PCR 扩增试剂包括引物、dNTPs、缓冲液等。
测序反应试剂包括测序平台特定的测序反应液、模板 RNA、酶等。
二代基因测序的应用领域二代基因测序技术在多个领域得到广泛应用，包括：基因组学、转录组学、表观遗传学、基因表达谱分析、基因突变检测、病原体检测等。
在基因组学领域，二代基因测序可以进行全基因组测序，揭示物种的基因组结构和功能；在转录组学领域，二代基因测序可以进行转录组测序，研究不同组织、不同发育阶段、不同处理条件下基因的表达情况。
我国二代基因测序的发展状况我国在二代基因测序领域取得了显著的发展。
2014 年初，国家卫计委和食药监督管理总局共同出台文件叫停二代基因测序服务，并着手推进试点工作。
二代测序技术简介
二代测序技术简介一、什么是二代测序技术？二代测序技术，也被称为高通量测序技术，是一种快速、高效的DNA 或RNA序列测定方法。
相比传统的Sanger测序技术，二代测序技术具有较高的测序效率和容量，能够同时测序数百万到数十亿个碱基对，大大提高了测序的速度和数据产量。
常用的二代测序技术包括Illumina 测序技术、Ion Torrent PGM 测序技术等。
二、Illumina二代测序技术的原理与过程1. 原理Illumina二代测序技术基于桥式扩增和碱基扩增的原理。
DNA样本经过打断、连接和PCR扩增等处理后，将单链DNA固定于特定表面上，并在每个DNA分子之间形成成千上万个桥式扩增复合物。
在模板DNA的存在下，通过逐个反复封闭、复制和荧光标记的方式，进行碱基的逐渐扩增，并利用荧光信号记录测序结果。
2. 过程（1）样本制备：包括DNA或RNA的提取、打断、连接和PCR扩增等步骤，以获得特定长度的DNA片段。
（2）文库构建：将DNA片段连接到Illumina测序芯片上的适配器上，并进行PCR扩增，形成DNA桥式扩增复合物。
（3）测序芯片加载：将DNA桥式扩增复合物置于测序芯片上，使得每个DNA分子都与芯片上的特定区域相结合。
（4）桥式扩增：通过逐个反复封闭、复制和荧光标记的方式进行碱基的逐步扩增，形成簇团。
（5）图像获取：利用高分辨率成像系统拍摄簇团的荧光信号。
（6）数据分析：将图像数据转化为碱基序列，通过比对和组装等算法，得到原始测序数据。
三、Illumina二代测序技术的优势和应用领域1. 优势（1）高通量：能够在较短时间内产生大规模的测序数据。
（2）高准确性：其错误率低于其他二代测序技术，能够提供高质量的测序结果。
（3）可扩展性：适用于不同规模的测序项目，从几个目标区域到整个基因组的测序，具有较高的灵活性。
（4）低成本：相对于传统的Sanger测序技术，具有更低的测序成本。
2. 应用领域（1）基因组学研究：能够对物种的基因组进行全面测序和变异分析，有助于揭示基因组结构和功能。
二代测序的原理和应用范畴
二代测序的原理和应用范畴1. 引言二代测序是一种高通量测序技术，已经广泛应用于生物学和医学研究领域。
本文将介绍二代测序的原理和其应用范畴。
2. 二代测序的原理二代测序技术利用了高通量平行测序的方法，可以快速并大规模地测序DNA 或RNA。
其原理主要可以分为以下几个步骤：2.1 文库构建文库构建是二代测序的第一步，其中需要将待测序的DNA或RNA片段进行处理，包括剪切、连接引物、PCR扩增等步骤。
2.2 DNA片段或RNA片段固定构建好的文库需要将DNA片段或RNA片段固定在适当的载体上，以便后续的高通量测序。
2.3 高通量测序固定好的文库将被分成数百万个微小的DNA或RNA片段，并通过高通量测序仪进行测序。
常见的高通量测序技术包括Illumina HiSeq、Ion Torrent和454 Pyrosequencing等。
2.4 数据分析测序完成后，会生成大量的原始测序数据。
这些数据需要进行拼接、比对、注释等处理，以获得最终的测序结果。
3. 二代测序的应用范围二代测序技术在许多生物学和医学领域都有广泛的应用，以下是其中的几个主要应用范围：3.1 基因组学研究二代测序技术可以对基因组进行高通量测序，包括整个基因组的测序、亚基因组水平的测序以及复杂基因组的测序。
这些研究可以帮助识别基因组的变异、揭示基因功能以及研究基因组的演化等。
3.2 转录组学研究转录组学研究通过测序和分析RNA片段，可以揭示细胞或组织中所表达的基因和它们的表达水平。
二代测序可以帮助识别RNA剪接变异、发现新的转录本以及研究基因表达的调控机制。
3.3 表观基因组学研究表观基因组学研究主要关注基因组中DNA的化学修饰，如DNA甲基化。
二代测序可以帮助确定DNA甲基化的位置和水平，从而研究基因表达与调控之间的关系。
3.4 生殖医学二代测序在生殖医学中有广泛的应用，包括遗传病的诊断、胚胎植入前遗传学诊断、新生儿疾病筛查等。
通过对胚胎或新生儿的基因组进行测序，可以帮助鉴定患有遗传疾病的个体，并提供相应的治疗和预防策略。
二代测序原理范文
二代测序原理范文二代测序原理（也称为高通量测序、下一代测序）是一种基因组测序技术，通过平行测序多个DNA或RNA分子，快速、高效地获得巨量的序列信息。
与传统的Sanger测序相比，二代测序具有更快的速度、更低的成本和更高的分辨率，广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域。
二代测序技术可分为四个主要步骤：测序文库制备、芯片成像、图像分析和序列解读。
以下将详细介绍二代测序的原理和每个步骤的具体过程。
一、测序文库制备：1. DNA/RNA片段制备：首先，从样本中提取DNA或RNA，并用切割酶将其切割成较小的片段（500-1000bp）。
2.适配物连接：接下来，在DNA/RNA片段的两端连接相应的适配物（引物），适配物上含有序列引导片段，用于后续PCR扩增和测序。
3.PCR扩增：通过PCR扩增，将适配物连接的DNA/RNA片段扩增为大量的同一序列，以提供足够数量的模板进行测序。
二、芯片成像：1.片段固定：采用各种方法，如PCR、桥式PCR、聚合PCR等，将测序文库的DNA/RNA片段固定到固相介质上，常见的固相介质有玻璃芯片和金属芯片。
2.测序原理：采用碱基荧光标记的测序方法，即根据测序过程中每一位碱基的荧光信号来识别所测序列。
3.多通道测序：通过分区域选择，将芯片划分为多个互相独立的小通道，使得多个实验可以同时进行，提高测序效率。
三、图像分析：1.图像获取：使用高分辨率成像设备（如CMOS或CCD相机），对芯片进行图像扫描，获取每个小通道的图像。
2.图像处理：对图像进行处理、消噪和自动识别，提取出每个通道的荧光信号数据，为后续的序列解读提供准确的数据支持。
四、序列解读：1.数据基准矫正：根据已知序列，对测序芯片上的各通道数据进行基准矫正，使得每个通道的碱基顺序正确无误。
2.序列还原：将碱基信号数据转化为对应的碱基序列，常用的基于互补配对关系的算法可以恢复最终的序列结果。
3.数据分析：对获得的序列数据进行序列比对、突变检测、RNA拼接、基因组组装等分析，从而得到更深入的生物信息学研究结果。
二代测序简介
Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
a
Sequential Sequenc e Extensio n Reaction
Polymerase
Ligase 12
2nd Generation Performance
1995 - ABI’s first automated DNA sequencer
2006 - 2nd generation DNA sequencer on market
2007 and beyond – Singleamolecule sequencing
4
Sanger’s
M eLatbheloeddprimer (1)
POLONATOR 连接酶 20G 17 × ~30×2 7天 1周 99% ~40% off
a
13
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
a
14
Roche/454 Workflow
DNA Library Prep
DNA Fragment
End repaired
Enzyme beads
Sulfurylase Luciferase
Packing beads help toa
Pyrosequencing
4 nucleotides sequentially flow in
Incorporation of a nucleotide releases a pyrophosphate (PPi)
GS 454
技术原理 聚合酶/焦磷酸酶
单运数据产量 0.4～0.6Gb
第二代DNA测序技术
Illuumina测序系统采用的是桥式PCR扩增
• （3）测序：加入测序试剂，在合成连结合一个碱基后，洗脱掉 游离的dNTP，然后在检测荧光信号后加入化学试剂淬灭荧光信 号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以此为一个循环，重复这个循 环即可测出该片段序列。
第二代DNA测序技术简介
• 第二代DNA测序技术包括：Roche公司的454技术、illumina公司的 Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术
• 核心思想：边合成边测序 • 特点：读长短、通量高，成本低、测序快
• Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台 测序原理：焦磷酸测序法—4种酶催化的同一反应体系中的酶级联 化学发光反应 • 焦磷酸测序法反应体系：1个特异性的测序引物和单链DNA模板，
• （4）测序：采用焦磷酸测序法，每个含有磁珠的小孔都可以测 出其中一个片段的序列。
• Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器 • 测序原理：类似Sanger测序法，dNTP的3’-OH被化学方法所保护，并带有碱
基特异荧光标记，因而每次只能添加一个dNTP，放出一个荧光信号。
454测序流程• （1）DNA制备：将待测DNA打断成300-800bp长的小片段， 末端修复后在片段两端加上不同的接头，变性处理回收单链DNA。
• （2）体外DNA扩增：454系统采用的是乳化PCR的方法进行扩增。
• （3）富集固定：将含有DNA片段的磁珠富集起来，并将这些磁珠 置于一种PTP平板中的特制小孔中，每个孔只能容纳一个磁珠。
（1）第一次连接引物n-1比第一轮错开一位，所以此次得到0，1位碱基对的颜 色信息
（2）化学处理后，第二次连接反应得到的是5，6位碱基对的颜色信息，第三 次是10，11位碱基对的颜色信息……
dna二代测序原理
dna二代测序原理
DNA二代测序原理
DNA二代测序是一种高通量测序技术，该技术基于先进的
DNA合成和测序方法，能够快速、高效地获得目标DNA序列的信息。
DNA二代测序的基本原理可以简要地描述为以下几个步骤：
1. DNA样本制备：首先，需要从待测样本中提取出DNA，并
进行必要的处理和纯化步骤，以保证获得高质量的DNA模板。
2. DNA文库构建：接下来，将目标DNA样本分割成较短的片段，并在每个片段的末端加入特定的序列适配器。
适配器是DNA序列，它们可以用作引物和标识序列，帮助后续扩增和
测序过程的顺利进行。
3. PCR扩增：通过使用适配器序列为引物，将文库中的DNA
片段进行大量的PCR扩增，得到更多的复制DNA片段，以增加可测序DNA的数量。
4. 测序反应：将扩增后的DNA片段与测序反应所需的酶、荧
光标记碱基、缓冲液等混合，进行测序反应。
在反应过程中，由于每个DNA片段的末端都标记有特定的荧光标记碱基，因
此测序机器可以通过检测荧光信号来确定每个DNA片段的序列。
5. 数据分析：测序仪会生成大量的测序片段数据，通常称为“reads”。
这些reads会被保存为文本文件，并通过专用软件进行数据分析，包括序列去重、碱基质量评估、 reads比对等步骤，最终得到目标DNA序列的信息。
DNA二代测序技术的优势在于其高通量、高效率和较低的成本。
通过密集并行地测序多个DNA片段，同时使用精确的光学检测技术，可以快速得到大量的DNA序列信息。
这使得DNA二代测序技术在基因组学、转录组学、表观基因组学等领域的研究中得到了广泛应用。
(完整版)二代测序内容
二代测序：第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。
DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。
早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。
随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。
Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。
然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。
这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。
虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。
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Roche/454 Workflow
• Bead Deposition
– One amplified bead per microwell – Followed by enzyme beads and packing beads – Enzyme beads
• • Sulfurylase Luciferase
SOLiD – ABI/Agencourt
SBL with dual base encoding
POLONATOR —Danaher Motion
SBL with base encoding
Next-Gen Sequencing Workflow
Fragment Library Preparation
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
Roche/454 Workflow
•
DNA Library Prep
– – – – – – DNA Fragment End repaired Asymetric Adaptors ligated (one biotinylated) Immobilized on streptavidin coated magnetic beads Denatured -> ss template DNA library Purified
Miniaturization through microfluidic Single molecule detection
测序技术目标
人类全基因组测序的目 标：1000美元/人
2008年预测5年内实现
2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组 Archon X大奖，奖金高达1000万美元。这项 大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到 100万美元的费用，完成100个人类基因组测 序的团队。附加条件是覆盖率不小于98%， 误差不大于1/100000 bp。
Emulsion Amplification Template DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead) Thermocyle to amplify (forward primer is biotinylated) Amplified beads enriched with streptavidin coated magnetic beads
Random Pair-end
Immobilization of Fragment
Clonal Amplification
Surface, Bead Covalent or non-covalent
Emulsion PCR Colony/Cluster
Sequence Read and Assembly
Large-scale and high-throughput Amplification on solid surface
Cluster generation (bridge or polony amplification ) Emulsion PCR (fragment on beads)
• 可以进行Pair－End测序研究；
功能强大的基因组分析工具
—Polonator G.007
Polonator系统是由Dr.
George Church和他的研究小 组发明，该系统使用了美国最
先进试剂处理和检测的部件 ，采用了最敏感的检测设备 ，现在已发展成为一个包含 多个基因组学应用领域的研 究平台，并且承担了美国 “Personal Genome Project”的个人基因组测序 任务。Polonator G.007最大的
数据量— 每次运行可以得到~10Gb的 高质量数据 运行时间— ~80小时 读长— 30bp×2，每次运行可以读取 1.2 ~1.3×109个磁珠 准确性— 超过99% 运行成本— 仅为目前二代测序系统运 行成本的60% 样品数/运行— 同时支持2 ×8道最多 16个样品测序
Sanger’s Method
Labeled primer (1) Sequence reactions (4) Sequence separations (4) Sequence read-out
1st-Generation Automated DNA Sequencer
Parallel runs on 96 capillaries on ABI 3700
连接反应测序：polonator连接反应的底物是 9碱基单链荧光探针混合物。探针的5’末端分别 标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种 颜色的荧光染料。连接反应中，这些探针按照 碱基互补规则与单链DNA模板链配对，结合的 探针就提供了一个荧光检测信号，最终被
仪器识别。
Polonator G.007
GS 454 技术原理 单运数据产量 覆盖人基因组 平均读长（bp） 样品准备 运行时间 精确度 单次运行价格 聚合酶/焦磷酸酶 0.4～0.6Gb 0.2× 400 2天 10小时 99％ 7万元 SOLiD 连接酶 50Gb 17× 50 7天 8天 99.94％ 3.5万元 SOLEXA 聚合酶 20Gb 6× 100×2 9小时 9.5天 98.5％ 2.5万元 POLONATOR 连接酶 20G 17 × ~30×2 7天 1周 99% ~40% off
第二代测序技术简介
公司理念：毅新兴业以生命科学研究为本，致力于科学技术服 务，为客户提供完美的科研平台 。
基因组 SNPs（包括芯片、massarray） 第二代大规模测序
自主仪器 试剂
恒温金属浴
梯度PCR仪 恒温振荡仪
自主研发
液体蛋白磁珠 SBI试剂
病毒包装
miRNA表达谱 蛋白组 血清多肽谱 2DE LC-MS（Shotgun法） 代谢组 NMR LC-MS
–
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
• 速度快，一个测序反应耗时10个 小时，获得100余万个读长和4-6亿 个碱基对。
• 测序读长最长，单个序列的读长更 长，平均可达到400-500个碱基左右
• 准确度高，读长超过400bp时，单 一读长的准确性可以超过99%； • 一致性好，测序结果一致性超过 99.99%；
优势在于开机运行成本低和 Linux 开放资源软件。
Polonator G.后，与中间接头连接，再环化，然 后用Mme1酶切，使中间接头两端各有~、 PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR（ Emulsion PCR）。 微球富集和固定：PCR完成之后，变性模板 ，富集带有延伸模板的微珠，去除多余的微珠 。将微珠沉积在一块玻片上，微珠上的模板经 过3’修饰，可以与玻片共价结合。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Image Processing
Post-acq Processing
Chemiluminescen t event maped to well Flowgram generated for each well Base called
De novo sequencing Resequencing Amplicon variant analysis
In situ sequencing by chain extension
Sequence by synthesis – DNA polymerase Sequence by ligation – DNA ligase
Massively parallel processing
Array of clusters, beads
Sequencing Cost
Sample handling Difficult to miniaturize
Need for Faster and Cheaper Sequencing Technology
Personal Genome Project
Trends in Next-Generation Sequencing
1992 - Affymatrix (Fodor’s group) first gene-chip
1995 - ABI’s first automated DNA sequencer
2006 - 2nd generation DNA sequencer on market
2007 and beyond – Single molecule sequencing techniques
陈竺，日本血吸虫基因组
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
Pyrosequencing
Convert PPi to ATP
Use ATP to generate light
Remove (d)NTPs and excess ATP
Roche/454 Workflow
•
Image Acquisition
– – By CCD camera coupled to the picotiterplate Chemiluminescent intensity reflects number of nucleotide incorporated in each flow; used to determine homopolymer region Up to 100 cycles