包涵体
包涵体的形成以及处理方法
包涵体得形成以及处理方法1包涵体形成得原因(1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体L２]。
原因可能就是合成速度太快,以至于没有足够得时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间得非特异性结合,蛋白质无法达到足够得溶解度等。
(2)重组蛋白就是大肠杆菌得异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成］。
(3)重组蛋白分泌序列得存在阻碍折叠,导致错误折叠分子得产生。
(４)重组蛋白得氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
(５)包涵体形成动力学研究表明,包涵体就是由部分变性得中阃体聚合而成。
因此,任何影响中间体稳定得因素,如pH值(ｐＨ接近蛋白得等电点时容易形成包涵体)离子强度与温度都可以引起蛋白聚合反应。
(6)在细菌分泌得某个阶段,蛋白质分子间得离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体得形成、(７)有报道认为,丰富得培养基有利于活性蛋白质得表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体？。
包涵体得处理包涵体得形成具有有利得一面,也有不利得一面、有利得一面就是包涵体得形成去除了几乎全部得细胞内可溶性蛋白质。
同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物得降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白得１0％～30％,甚至高达５0％。
不利得一面就是溶解包涵体进行复性折叠得过程中需要加变性剂与去垢剂,而引起蛋白质得不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性得操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解与沉淀,有些还形成异构体【s] ５。
因此复性就是蛋白质工程中最关键、最复杂得问题。
包涵体得处理一般有如下几个步聚。
破碎细菌细胞提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌得过程中目得蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适得缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加入保护剂,如还原剂DTT(２一巯基苏糖醇)、２一巯基乙醇;加防止水解酶作用得试剂,如酶得抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。
包涵体
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/ 毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
包涵体、多角体、噬菌斑、空斑、枯斑比较
包涵体、多角体、噬菌斑、空斑、枯斑的异同
∙在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
∙多角体polyhedra 是指随着某种昆虫病毒的感染，核内或细胞质中形成直径0.5-10微米的多面体，由晶状排列的碱溶性蛋白质组成，中间包藏着数目不定的病毒粒子。
它的功能是保护病毒颗粒免受外界各种不良环境的破坏，它对各种蛋白分解酶有抗性，而在碱中易溶解，释出病毒粒子。
∙噬菌斑，即噬菌体侵染细菌细胞，导致寄主细胞溶解死亡·因而在琼脂培养基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑，或称负菌落。
∙空斑( lacuna)在将产生大肠杆菌素的细菌和对该种大肠杆菌素敏感的指示菌与软琼脂混合涂在琼脂面上培养时，即可见到单个细胞产生的大肠杆菌素对指示菌起生长抑制作用的小形抑制斑，这就是空斑。
∙植物病毒侵染敏感植物叶片，被感染部位的细胞快速死亡而形成局部坏死斑，或称枯斑。
相同点：
1.前两者都是微生物抵抗外界形成的休眠体
2.后三者都是病毒引起的肉眼可见的现象
不同点：
1.包涵体是大肠杆菌休眠体，多角体是病毒休眠体
2.噬菌斑是细菌死亡的斑，空斑是细菌抑制细菌生长的斑，枯斑是植物坏死部分。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
什么是包涵体
包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。
包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
包涵体（inclusion body）基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
基因工程包涵体的纯化方法
基因工程包涵体的纯化方法基因工程可真是个神奇的领域，像是现代科技的魔法师，把DNA这个小家伙们玩弄得团团转。
在这片神秘的土地上，包涵体就像是隐藏的宝藏，得先把它们找出来，再通过纯化的方法把这些小宝贝洗净，才能让它们为我们所用。
今天，我们就来聊聊基因工程包涵体的纯化方法，让这趟旅程轻松愉快。
1. 什么是包涵体？首先，包涵体可不是某种古怪的生物，它们其实是细胞在生产某些蛋白质时，形成的一种颗粒。
就像是做饭时，锅里油烟聚集的那些小油滴，虽然它们看起来不太好，但里面可藏着好东西。
你要知道，包涵体里面有大量的目标蛋白质，但通常它们会和其他杂质混在一起，像是大海捞针，得费点功夫才能捞出来。
1.1 包涵体的形成当细胞用上基因工程的技术，强行让某种蛋白质“上班”时，有时候它们就会不太乖，聚集成包涵体。
这就像你在做作业时，有的题目就特别难，结果一堆答案写错了，最后只好把它们堆到一边。
虽然包涵体一开始可能看起来像个废物，但其实它们是生产特定蛋白质的一种“副产品”。
1.2 包涵体的用途那包涵体有什么用呢？别小看了它们，它们可是制药、疫苗开发的重要角色。
有的包涵体能转化为活跃的蛋白质，成为我们需要的药物，甚至可以用于研究新治疗方法，简直就是科研界的“黑马”。
所以，找到它们、纯化它们，那可是相当重要的任务。
2. 包涵体的纯化步骤接下来，我们就要聊聊如何把这些包涵体给纯化出来，步骤其实不复杂，但得有点耐心。
2.1 细胞裂解首先，得把细胞给撬开，就像剥开一个鸡蛋，才能见到里面的蛋黄。
这里我们通常会用一些裂解缓冲液，像是加盐的水，帮助细胞膜变得松软。
然后，咱们可以用超声波处理、化学试剂或者冷冻融化的方式把细胞打散，让包涵体慢慢浮出来。
2.2 离心分离一旦细胞裂解，包涵体就会在液体中游荡。
这时候，就要用离心机来大显身手了。
离心机就像是一位厨师，用强大的“旋转功力”把细胞残骸和包涵体分开。
你可以想象，把一大锅汤放进离心机，旋转后，沉淀物就会在底下，清汤会在上面。
包涵体
包涵体（inclusion body）基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子包涵体，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。
多为圆形、卵圆形或不定形。
一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。
有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。
昆虫病毒可根据包涵体的形状、位置而分为细胞质型多角体病毒、核型多角及颗粒体病毒等。
组成与特性一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、包涵体RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白沙眼衣原体包涵体间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
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5、以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物 活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到 具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白， 体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。
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四、包涵体破菌、分离、洗涤、溶解
1 、破菌 基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：
机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规 模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量 传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞 悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混 在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大 规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再 结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度 和回收率。
Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，
而以可溶形式出现。
6 、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子
键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
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三、包涵体表达的有利/有害因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包 涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提 高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速 离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与 细胞膜碎片分离。
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2 、分离 5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉
淀，与可溶性蛋白分离。
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3 、洗涤 包涵体沉淀中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成
分，如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。由于这 些脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一 起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤。洗涤常用低浓度 的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加 EDTA和还原剂二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等， 因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤 包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至 少可达50%以上，而且可保持原结构。
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也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂 /EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部 分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理 条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。 EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、 脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤 去除杂质，这一步很重要，因为大肠杆菌外膜 蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋 白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中 可导致重组蛋白质的降解。
胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由
于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因
子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积
累，容易形成包涵体沉淀。
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5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH
的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较
关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和
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二、包涵体形成的原因
包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过
程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，
无法形成正确的次级键等原因形成的。具体的原因可
能有以下几点：
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1 、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常
的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱
和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少
形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能
是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二
硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫
氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明
显与包涵体的形成呈正相关。
3 、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或
包涵体的纯化
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一、包涵体的定义
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成 无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白， 其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白 ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA， 以及脂体、脂多糖等。
大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml）， 无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍 等。
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用超声波破碎法在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、 超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变 清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声 波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
此外还有高速组织捣碎法，玻璃匀浆器匀 浆 ，反复冻融法 ，化学处理法 。
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无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋 白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解， 导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP） 可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活 性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰 氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全 部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过 选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于 目的物质的提取。
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实验室用的是低浓度的变性剂—2M尿素在 50mM Tris pH8.0，1mM EDTA中洗涤和用温 和去垢剂1% TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜 蛋白。
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4 、溶解 变性蛋白只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质 变性本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级 结构的变化。包涵体的溶解主要任务是拆开错配的 二硫键和次级键 。
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变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其 分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级 结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结 果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸，强碱，重 金属盐，尿素，乙醇，丙酮等；能使蛋白质变性的物 理方法有加热，紫外线照射，剧烈振荡等。 重金属盐 使蛋白质变性，是因为重金属阳离子可以和蛋白质中 游离的羧基形成不溶性的盐，在变性过程中有化学键 的断裂和生成，因此是一个化学变化。