KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达
重组人表皮生长因子型
重组人表皮生长因子型前言人体皮肤是最大的器官，它不仅是身体的保护屏障，还承担着调节体温、排泄废物和感知外界刺激等重要功能。
皮肤的健康与人体整体健康密切相关，因此研究和了解皮肤生长因子对于保护皮肤健康具有重要意义。
本文将重点探讨重组人表皮生长因子的作用及其在医学和美容领域的应用。
二级标题1：重组人表皮生长因子的概述三级标题1：重组人表皮生长因子的定义重组人表皮生长因子是通过基因重组技术获得的一种蛋白质，它具有促进细胞增殖和修复受损组织的功能。
表皮生长因子是一类多肽激素，其中最具代表性的是表皮生长因子（EGF）和角质形成促进因子（KGF）。
重组人表皮生长因子通过模拟和增强体内天然生长因子的功能，可以促进肌肤细胞的再生和修复，改善皮肤质量。
三级标题2：重组人表皮生长因子的结构与功能重组人表皮生长因子的分子结构由176个氨基酸组成，具有生物活性。
它通过结合细胞表面的EGF受体，激活下游信号通路，促进细胞的增殖、分化和迁移。
重组人表皮生长因子还可以刺激胶原蛋白和弹力纤维的合成，增强皮肤的弹性和紧致度。
三级标题3：重组人表皮生长因子的来源与制备重组人表皮生长因子可以通过基因工程技术在大肠杆菌中表达和纯化得到。
首先，将人体表皮生长因子的基因序列克隆到质粒中，然后转移到大肠杆菌中进行表达，最后通过离心、层析等步骤，纯化得到重组蛋白。
制备好的重组人表皮生长因子可以应用于药物研发和美容产品中。
二级标题2：重组人表皮生长因子的应用三级标题1：医学领域中的应用重组人表皮生长因子在医学领域有广泛的应用。
它可以用于治疗烧伤、创伤和溃疡等皮肤损伤。
重组人表皮生长因子可以促进创伤表面的上皮化，加速伤口的愈合，减少感染和疤痕的发生。
此外，它还可以用于治疗干燥性皮肤病和老年性皮肤萎缩症等皮肤疾病。
重组人表皮生长因子的应用为各种皮肤疾病的治疗提供了新的选择和希望。
三级标题2：美容领域中的应用重组人表皮生长因子也被广泛应用于美容领域。
鸡FGL2基因的克隆分析及原核表达
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1 洛阳市活载体生物材料与动物疫病重点实验室,河南 洛阳 471003;
2 河南科技大学 动物科技学院
功能微生物与畜禽健康实验室,河南 洛阳 471003)
[摘
要] 【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白 2(
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力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析(最全)word资料
生物工程学报 Chin J Biotech 2021, July 25; 24(7): 1180-1185 journals.im.ac Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac © 2021 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析张兵兵1,2, 江鹏1,2, 鲜成玉1,2, 李玉筱1,2, 李大军1,2, 唐丽灵1,2, 王远亮1,21 重庆大学生物工程学院, 重庆 4000302 重庆大学“985工程”生物材料与仿生工程研究中心, 重庆 400030摘要: MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。
通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列,使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。
重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/再对融合蛋白EK酶切, rpHPLCdes(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。
分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。
生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。
关键词: 胰岛素样生长因子-1, 力生长因子, 原核表达, 增殖, 迁移Expression of Mechano-growth Factor in Escherichia coli and Activity Analysis Bingbing Zhang1,2, Peng Jiang1,2, Chengyu Xian1,2, Yuxiao Li1,2, Dajun Li1,2, Liling Tang1,2, and Yuanliang Wang1,21 Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400030, China2 National “985 Projiect Programme” Research Center of Bioinspired Materials Science and Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China Abstract: Mechano-growth factor (MGF) is one of IGF-1 isoforms. MGF is mechanosensitive and has important functions in muscle hypertrophy, regeneration and nerve injury recovery. In this study, MGF cDNA (330 bp) was cloned from stretched osteoblasts by RT-PCR. In order to avoid prolin residue inhibiting enterokinase cleavage, 9bp of MGF cDNA 5′ end sequence was truncated by primer, then the obtained truncated MGF (des(1-3)MGF) cDNA (321 bp) was subcloned in pET32a(+) vector to construct a prokaryotic recombination expression plasmid. Trx/des(1-3)MGF fusion protein, existing in formsof solution, was expressed in transformed Escherichia coli strain BL21(DE3) by IPTGinduction at 30oC. The supernatant of cell lysates was subjected to ion exchange chromatography and Ni2+ metal affinity chromatography, and the fusion protein was obtained with the purity over 95%. After the fusion protein was cleaved by enterokinase, Trx and des(1-3)MGF was isolated by reverse-phase HPLC. Through these procedures, des(1-3) MGF was obtained with the purity of 98%. The protein molecular mass was conformity to the theoretical value by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis. The purified des(1-3)MGF was incubated with MC3T3-E1 for cell proliferation and migration assays. The results show that des(1-3)MGF exhibited more facilitative effects on proliferation and migration of MC3T3-E1 than that of des(1-3)IGF-1.Keywords: insulin-like growth factor-1(IGF-1), mechano-growth factor (MGF), prokaryotic expression, proliferation, migrationReceived: November 8, 2007; Accepted: January 18, 2021Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30600130). Corresponding author: Yuanliang Wang. Tel: +86-23-65102509; E-mail:cqingzbb@163自然科学 (No. 30600130)资助。
GFP基因的克隆与表达操作步骤
GFP基因的克隆与表达一、碱裂解法质粒DNA的小量提取所涉及溶液的配制：Solution Ⅰ： 50mmol 葡萄糖25mmol Tris Cl (pH8.0)10mmol EDTA (pH8.0)Solution Ⅱ： 0.2mol NaOH1% SDS使用前现配现用Solution Ⅲ：每100ml含： 5M KAC 60.0ml冰乙酸 11.5ml蒸馏水 28.5mlTE Buffer： 10mmol Tris Cl (pH8.0)1mmol EDTA (pH8.0)（1）取单菌落于5ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，于37℃、200-250rpm振荡培养过夜（农杆菌在YEB培养基中，于28℃、250rpm振荡培养，时间相对长些）；（2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃、12000rpm离心1分钟，吸弃上清（可重复一次，若菌种需要保存，需要在无菌条件下操作）；（3）向离心管中加入100－150l用冰预冷的Solution Ⅰ，用旋涡振荡器或用微量移液器吹打重悬沉淀；（4）加入200l新配制的Solution Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次（注意动作幅度不要太大），冰上放置5分钟(仔细观察加入Solution Ⅱ后有何现象出现？)；（5）加入150l用冰预冷的Solution Ⅲ，轻轻混匀（观察有何现象出现？），冰上放置3~5分钟；（6）用微量离心机于4℃、12000rpm离心5分钟，将上清转移到另一离心管；（7）加等体积酚、酚:氯仿(1:1)、氯仿抽提，振荡混匀，用微量离心机于4℃、12000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中；（8）向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2分钟；用微量离心机于4℃、12000rpm离心5分钟，弃上清（9）用70%乙醇洗涤1~2次，再次4℃、12000rpm离心5分钟，沉淀于空气中干燥10分钟；用适量TE buffer溶解质粒DNA，加入1l 10mg/ml RNA酶，37℃处理1小时后使用或于-20℃贮存。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）.. 95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
猪源抗体基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
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（ １ ． 中国农业科 学院 哈尔 滨兽医 研究所 兽 医生物 技术 国家重 点实验 室 ／ 猪传染 病研 究室 ，黑龙 江 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ０ １ ； ２ ． 哈 尔滨师 范大 学 生 命科 学与技术 学 院 ，黑龙 江 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ２ ５ ）
摘
要 ：为 制备 原 核 表 达猪 源重 组 抗体 ，本研 究利 用 Ｆ Ｉ Ｔ Ｃ标 记 的 山 羊抗 猪 Ｉ ｇ Ｇ 标 记 猪 外 周 血淋 巴 细胞 ，通
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ８ — ０ ５ ８ ９ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ９ ． １ ５
猪 源抗体基 因的克隆及其在大肠杆菌 中的表达
基因克隆及在大肠杆菌中的表达
KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达1引言角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。
1.1 KGF-2的来源和基因结构KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。
此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。
人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。
1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。
理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。
Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。
1.2 KGF-2的功能KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。
KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。
KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。
此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑[3]。
KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。
KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。
KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。
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KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达1 引言角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10， FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。
1.1 KGF-2的来源和基因结构KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。
此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。
人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。
1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。
理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。
Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。
1.2 KGF-2的功能KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。
KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。
KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。
此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑[3]。
KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。
KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。
KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。
在脊椎动物器官形态发生过程中， KGF-2 在间充质-上皮相互作用中十分关键，如在四肢形成过程中，KGF-2在侧板中胚层的有限区域表达，它诱导尖外胚层嵴细胞的分化，刺激细胞增殖导致肢芽形成[6]。
脊椎动物器官的分支状形态发生也与FGFs家族相关，研究表明在小鼠肺的发育过程中，KGF-2可能是一个十分关键的生长因子和趋化物质[7]。
其它经历分支状发生的器官，像泪腺和胰腺，KGF-2在其发育过程中也发挥一定作用[8,9]。
另外，KGF-2几乎参与颅面区所有的结构发育，无论是早期的形成过程，还是后期的生长调节，KGF-2/KGFR2b 信号通路都是十分关键的[10]。
在生殖系统的发育过程中，KGF-2 也起着重要的作用。
在前列腺的发育过程中，间充质通过分泌KGF-2 等细胞因子来诱导前列腺上皮细胞发育。
Donjacour等研究 FGF-10雄性小鼠模型时发现，大多数这种小鼠出生时雄性第二性器官缺失或萎缩，包括前列腺、精囊、尿道球腺和尾部输精管[9]。
另外，Yucel等利用基因敲除小鼠模型证实，KGF-2 等生长因子在生殖结节的正常发育过程中协同其他细胞因子起着非常重要的作用[10]。
这些研究结果说明 KGF-2可能在前列腺和其他附属性器官发育中起十分重要的作用。
目前已经发现KGF-2在脊椎动物四肢、牙齿和毛发（羽毛），以及肺、耳、盲肠、颌下腺、胰腺和前列腺等器官的形成过程中起着极为重要的作用[11]。
KGF-2也有辐射防护作用[12]。
KGF-2可以提高辐射后小鼠的肠干细胞的存活率，并对辐射引起的气道上皮细胞的通透性升高具有拮抗作用。
Knan等人应用离子微集落刺激法发现，KGF能显著降低辐射引起的肠道损伤。
Waters和Savla 等人用测定荧光素异硫氰酸盐标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的外渗来反应培养的Calu-3和16HBE140单层细胞的通透性，结果发现在同等剂量的辐照条件，KGF（50ng/ml）预处理的培养单层细胞对FITC-BSA的通透性明显下降，而KGF对未辐射过的单层细胞的通透性无影响。
通过激活蛋白激酶C（PKC），KGF可以加速辐射诱导的DNA损伤修复，并维持细胞骨架蛋白F-肌纤蛋白的稳定和保护细胞间连接。
1.3 Kgf-2在大肠杆菌中的表达优势近年来的研究发现kgf-2基因在毕赤酵母中表达时，目的产物容易遭受宿主蛋白酶的降解[13]。
大肠杆菌表达系统具有容易操作、能高效表达的特点，而且就重组蛋白的生物学活性而言，两种方式表达的重组蛋白均具有类似天然蛋白的生物学功能，其刺激NIH/3T3细胞增殖能力也几乎相当。
因此本研究希望利用大肠杆菌表达系统来实现该基因的高效稳定表达。
2 主要仪器及原料2.1 材料2.1.1 菌株来源BL21菌株由军事医学科学院馈赠2.1.2 寡核苷酸引物实验所需引物由上海生工公司合成pet28kgf(+)：CGGAATTCGGTCAAGACATGGTGTCACCpet28kgf(-)：CGCTCGAGTTATGAGTGTACCACCATTGGA2.1.3 试剂PCR反应体系：dNTP溶液，Taq酶，XhoⅠ，Mg2+溶液DNA电泳体系：琼脂糖，MarkerⅢ，6×loading Buffer ，TAE 缓冲液，Goldview蛋白电泳体系：10%过硫酸铵，TEMED，巯基乙醇，30% 胶母液，分离胶缓冲液（pH 8.8），浓缩胶缓冲液（pH6.8），10×电极缓冲液（pH 8.3），2 ×上样缓冲液，染色液，脱色液试剂盒：质粒提取试剂盒，PCR产物回收试剂盒培养基：LB液体培养基，LB固体培养基溶液：60mmol/L氯化钙溶液抗生素：卡那霉素，氨苄青霉素2.2 实验仪器PCR仪：Eppendorf公司DNA电泳仪：北京六一蛋白电泳仪：北京六一低温离心机：美国Beckman公司摇床：ZHWY2008B制冰机：SIM-F124（SANYO）恒温水浴锅：GFL1002超低温-20冰箱：MDF-U5410（SANYO）4 ℃冰箱：BCD-257SLB漩涡混匀器：VORTEX-GENIE2超净工作台：HD-1360新型格兰仕WD750ASL23微波炉电转化仪3 实验方法[14,15]3.1 质粒DNA的提取分别取BL21（pET28a）和BL21（pET22b kgf-2）菌液接种于5ml(含氨苄青霉素和卡那霉素)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，各自用试剂盒法提取质粒DNA ，步骤如下：（1）将5 ml菌液13 000rpm离心30s，收集沉淀。
（2）倒掉上清，将沉淀完全悬浮于100μl悬浮液（溶液Ⅰ）中。
（3）加入150μl裂解液（溶液Ⅱ）轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠清亮。
（4）加入150μl中和液（溶液Ⅲ），轻柔地颠倒混匀10次左右。
（5）13 000rpm离心8-10分钟左右，将上清液小心转移入一个新的1.5 ml离心管中，加入等体积的（约400μl）结合液，颠倒混匀。
（6）将混合液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13 000rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。
（7）将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μl 80% 的异丙醇，13 000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
（8）取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5 ml 离心管，开盖放置2-3分钟，加入50μl 双蒸水于硅胶膜上，不能粘在管壁上，室温下放置5分钟后，13 000rpm离心1分钟。
（9）将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次，这样可获得较高产量的质粒DNA。
（10）离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA。
模板pET22b 重组子质粒电泳确认后准备进行PCR，pET28a质粒电泳确认后4℃保存准备酶切。
3.2 PCR扩增目标基因（1）取一个PCR管，在其中按顺序添加以下各成分反应液反应液：正链引物pet28kgf(+) 1μl负链引物pet28kgf(-) 1μldNTP 1μlBuffer 5μl模板pET22b重组子1μl双蒸水40μlTaq酶1μl总体积50μl（2）稍作离心。
（3）将反应管放入PCR仪中，按下列条件设计好程序，进行PCR反应。
（4）反应程序：94 ℃ 条件下模板DNA预变性5分钟变性94 ℃ 30s退火52℃ 30s延伸72 ℃ 2min30个循环后，72 ℃ 条件下延伸10min补平单链。
（5）PCR反应结束后取2μl反应液用1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。
（6）电泳确认后，余下的PCR产物用试剂盒法进行纯化。
3.3 酶切A PCR产物酶切体系O 33μlddH2PCR回收产物10μlEco RⅠ 1μlXhoⅠ 1μlXhoⅠ缓冲液5μl定容50μlB pET28a 酶切体系第一次酶切：ddHO 34μl2pET28a 10μlEco RⅠ 1μlEco RⅠ缓冲液5μl定容50μl酶切产物经回收后，进行第二次酶切第二次酶切：ddHO 34μl2pET28a 10μlXhoⅠ 1μlXhoⅠ缓冲液5μl定容50μl（1）用手指轻弹管壁使溶液混匀，用离心机甩一下，使溶液集中在管底。
（2）混匀反应体系后，将Eppendorf管插于泡沫塑料板上，37 ℃水浴下反应6-8小时。
（3）酶切完全后用试剂盒法纯化产物。
（4）取2μl纯化后产物进行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，确认酶切是否完全。
3.4 连接（1）在一1.5mlEppendorf 管中加入2μl酶切后的载体pET28a和6μl酶切后的PCR产物片断。
（2）添加1μl的10 ×DNA缓冲液以及1μl的DNA连接酶。
即 PCR产物6μlpET28a 2μl10× 连接缓冲液1μlT4连接酶1μl总体积10μl（3）混匀后用离心机将液体全部甩到管底。
（4）16℃ 条件下保温过夜。
（5）利用宿主的感受态细胞进行转化实验。
3.5 转化3.5.1 细菌感受态的制备（1）取5μl的BL21菌种接种于5 ml的LB培养基中，37℃ 振荡培养过夜。
（2）取100μl培养液转接于5 ml的LB液体培养基中37℃振荡培养达0.4左右。
2-2.5小时左右，使A600（3）将培养液1.5ml移至Eppendorf 管中，冰浴20分钟，使其停止生长。
（4）4℃条件下，3 000r/min离心5分钟，弃取上清液。
（5）添加0.75 ml预冷的60mmol/L氯化钙溶液，用枪轻轻吹打。
（6）冰浴20-30分钟后，4℃条件下，3000r/min离心5分钟，尽可能弃取上清液。