基因克隆与表达
基因克隆和表达技术及其应用研究
基因克隆和表达技术及其应用研究在现代生物技术领域，基因克隆和表达技术被广泛应用于生物医药、农业生产、环境保护等多个领域，是一项重要的研究方向。
本文将介绍基因克隆和表达技术的原理、工具和应用，旨在深入探讨该技术在现代生物科技领域中的应用价值。
一、基因克隆的原理与工具基因克隆是指将目标DNA片段放入载体中，通过复制和传递，获得大量相同的DNA分子的过程。
基因克隆需要用到一系列工具和分子生物学技术。
其基本的步骤包括：DNA提取、限制酶切割、连接和转化等。
DNA提取是指从细胞中获取目标DNA，一般从细胞核中提取DNA样品。
限制酶切割是一种利用特定的限制酶将DNA切割成不同长度的碎片的技术。
连接是指将目标DNA片段与载体DNA进行配对，在适当的连接条件下会形成一个大的DNA分子，也称作重组DNA。
最后的转化是将重组DNA重新引入一个宿主细胞，使其进行繁殖。
这些步骤组成了一个典型的基因克隆工作流程。
在基因克隆中，一些关键工具也是必不可少的。
例如，限制酶和DNA连接酶是进行酶切和连接的酶类；载体是将目标DNA载入的载体分子。
当然，在实验设计过程中，也需要考虑到多种子序列的选择，以获得最优的结果。
二、基因表达技术基因表达技术是指将克隆好的基因转录和翻译为蛋白质的过程。
基因表达技术所涉及的核心部分主要为转染和转录。
转染是指将载体转化到目标细胞中的过程。
转染可以分为多次批量的直接转染和、转染载体的两种方式。
对于细胞质和细胞核分离的情况，病毒载体或质粒载体也可以被用来介导转录。
质粒载体在转录的时候需要被移入到细胞的核中，由此促进了 DNA 受体和 RNA聚合酶之间的相互作用。
另一种重要的基因表达技术是转录，也称作转录调节。
转录调节可以分为两类：正调节和负调节。
正调节是指通过上调特定基因的表达、促进特定转录的过程；负调节是指通过下调特定基因的表达、抑制特定转录的过程。
转录调节受到多种因素的影响，例如转录因子和超融合酶等分子的运作。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
《基因克隆与表达》课件
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
现代分子生物学技术
CATALOGUE
目录
基因克隆与表达 基因组学与蛋白质组学 基因编辑技术 生物信息学 分子生物学技术的应用
01基因克隆与表达基因构建通过构建基因，将特定基因的DNA片段插入到载体中，以便于基因的筛选和克隆。
限制性酶切和连接
利用限制性内切酶对DNA进行切割，再通过DNA连接酶将目的基因与载体进行连接，实现基因的克隆。
基因编辑技术的应用
04
生物信息学
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01
02
03
克隆基因的表达载体
02
基因组学与蛋白质组学
基因组学研究方法
基因组学研究主要采用全基因组测序、基因表达分析、基因突变检测等技术手段。
基因组学应用
基因组学在医学、农业、生物技术等领域有广泛应用，如疾病诊断、药物研发、农作物改良等。
基因组学定义
基因组学是研究生物体基因组的学科，包括基因的识别、测序、分析和功能研究。
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生物信息学
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生物信息学
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基因克隆与表达
精选2021版课件
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAG精E选2021版课件
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
精选2021版课件
5
1、连接
连接、转化与重组子鉴定
精选2021版课件
6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
精选2021版课件
7
2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度 不高，连接缓冲液宜分装；
单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
精选2021版课件
15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
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+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
精选2021版课件
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基因克隆与表达
5、原核生物中参与转录的基因结 构：
• 启动子 • 终止子
基因克隆与表达
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。 • 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区：
基因的克隆与表达
基因克隆与表达
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因克隆与表达
基因克 隆 Gene Cloning
基因克隆与表达
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因克隆与表达
一、概述
一个相同酶切位点，可将另一末端补平
基因克隆与表达
2、平末端连接： • 酶切点为平末端或任何两个末端补平
的DNA • 效率低，酶用量大
基因克隆与表达
3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡
核苷酸片段
基因克隆与表达
4、T-A克隆 • T-vector两条链的5’端含有一个游
离的T • PCR过程中，普通的Taq酶可在产
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因克隆与表达
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在 一起，形成操纵子。
基因克隆与表达
操纵子（operon）：是一组功能上相 关，受同一调控区控制的基因组成的 一个遗传单位
基因克隆与表达
• 原核生物基因表达的基本单位（即一 个转录单位）。
• 共同协调作用，完成某一多肽的表达 调控。
无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性
基因克隆与表达
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
基因克隆与表达
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷 • 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有
基因克隆与表达
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
基因克隆与表达
基因克隆与表达
二、克隆载体 ➢复制基因(replicator) ➢选择性记号 ➢克隆位点
基因克隆与表达
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
• 揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机理
• 提出了中心法则和操纵子学说，破译了 遗传密码
基因克隆与表达
1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
➢所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞
基因克隆与表达
4、PCR扩增目的基因片段 • 适用于克隆序列清楚的基因 • 以基因组DNA为模板，直接进行PCR
扩增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
基因克隆与表达
5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display,
DD)—筛选差异表达的基因
基因克隆与表达
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
基因克隆与表达
二．原核生物基因结构和表达特点
基因克隆与表达
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因克隆与表达
library)以组织细胞中的mRNA为模 板，反转录合成双链cDNA ，各 cDNA分子分别插入载体形成重组子， 再导入宿主细胞克隆扩增。这的3’端多加一个A
基因克隆与表达
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PBiblioteka BaiduR
5、人工合成
6、差异显示
基因克隆与表达
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组、鉴定：
• 长度鉴定：酶切、PCR
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
基因克隆与表达
基因的表达
Gene Expression
基因克隆与表达
一．表达系统： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白 质的体系，包括克隆载体，表达载体及 受体细胞。
基因克隆与表达
基因克隆与表达
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原 核细胞中以发酵形式快速高效地表达、 合成基因产物的体系。
基因克隆与表达
基因克隆（分子克隆molecular cloning）----通过体外重组技术,将一 段目的DNA经切割、连接插入适当载 体，并导入受体细胞，扩增形成大量 子代分子的过程。
基因克隆与表达
基因克隆的核心-----体外重组 (Recombination) : 人工将一段目的DNA 插入一个载体的过程。
基因克隆与表达
•构建流程
抽提基因组 DNA 鸟枪法制备DNA片 段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、 免疫结合法）
基因克隆与表达
• 特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况
基因克隆与表达3、构建cDNA，筛选目的基因 • cDNA(complementary DNA